淮南市新型冠状病毒感染病例实验室核酸检测结果分析

曾凡荣 刘江 杨光 王小波 张洁 何玢 朱利杰 孙梦阳 余寿杰

自2019年12月湖北省武汉市首次报道感染新型冠状病毒肺炎(COVID-19)[1]以来，疫情迅速在湖北省及国内其他地区蔓延[2,3]，目前由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）所导致的新型冠状病毒肺炎已被纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病并采取甲类传染病的预防和控制措施[4]。国家卫生健康委员会办公厅《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第五版）（试行第六版）》[5]指出，新型冠状病毒属β属正冠状病毒亚科，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140 nm，其基因结构特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别，但形成了另外一簇的进化分枝，成为继α-冠状病毒的HCoV-229E和HCoV-NL63、β-冠状病毒的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV之后，可以感染人类的冠状病毒科中的第七个成员[6]。

新型冠状病毒核酸检测常用标本为上呼吸道标本（咽拭子）和下呼吸道标本（深咳痰液）[7]。对于淮南市新型冠状病毒核酸检测结果进行分析，有利于掌握淮南市新型冠状病毒流行的特点，预测淮南市新型冠状病毒流行趋势，对控制新型冠状病毒肺炎具有非常重要意义。

材料与方法

1 材料

1.1 标本：按照最新《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》[8]要求，同时采集淮南市新型冠状病毒肺炎疑似病例的上呼吸道咽拭子和下呼吸道深咳痰液标本，咽拭子放入装有3 mL hank's液、庆大霉素、真菌抗生素病毒保存液的采样管中，深咳痰液放入螺口痰杯，标本采用A类包装放入干冰低温环境尽快运送至实验室。

1.2 主要试剂和仪器：病毒RNA提取试剂盒665A46、665S46均购自台湾圆点奈米技术股份有限公司（Taiwan Advanced Nanotech TAN Bead）；核酸商品化检测试剂盒：2019新型冠状病毒（ORF1ab/N基因）核酸检测试剂（双重荧光PCR法）购自上海伯杰医疗科技有限公司；荧光PCR仪：CFX96 Touch实时荧光定量PCR仪，RocheLightCycler480Ⅱ高通量实时荧光定量PCR仪。

1.3 引物和探针：上海伯杰医疗科技有限公司新型冠状病毒引物和探针选用中国疾病预防控制中心推荐的实验验证的产品：

靶标一（ORF1ab）：

正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA

荧光探针（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTG GAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

靶标二（N）：

正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

荧光探针（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACA GATT-TAMRA-3'

2 操作方法

2.1 病毒RNA核酸提取：病毒RNA核酸提取在生物安全Ⅱ级实验室内进行， 痰液标本在生物安全柜内用一支3 mL病毒采样管的保存液稀释，咽拭子、痰液充分振荡，分别取300 μL标本用核酸提取仪（磁珠法）提取核酸，操作步骤按照说明书进行，收集模板RNA。

2.2 Real-time RT-PCR：采用上海伯杰医疗科技有限公司的成品试剂盒，对标本检测开放读码框1ab(ORFlab)、核壳蛋白（N）病毒特异性核酸片段，反应体系，反应参数及具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，有效期内使用。扩增程序见表1。

表1 Real-time RT-PCR扩增程序

3 结果判断 检测结果严格按照最新《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》[8]判定，实验室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个：①同一份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORFlab、N）实时荧光RTPCR检测结果均为阳性，如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新采样，重新检测。如果仍然为单靶标阳性，判定为阳性。②两种标本实时荧光RTPCR同时出现单靶标阳性，或同种类型标本两次采样检测中均出现单个靶标阳性的检测结果，可判定为阳性；上海伯杰商品化试剂盒说明书要求：ORFlab基因检测通道为FAM，N基因检测通道为HEX/VIC，扩增曲线呈S型，且Ct值≤35为阳性，Ct值越小，病毒含量越大；扩增曲线呈S型，且35＜Ct值≤38需要复检；复检结果若一致，则判定结果为该基因核酸检测阳性；咽拭子或痰液标本中有任何一个核酸检测结果阳性即判定该病例为阳性[8]。

结 果

1 实验室检测情况 根据国家卫生健康委员会办公厅《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》要求：疑似病例连续两次呼吸道病原核酸检测阴性（采集时间至少间隔1天）方可排除。淮南市新型冠状病毒从发现到零确诊共检测新型冠状病毒肺炎疑似病例336例，实验室核酸检测阳性结果27例，阳性率为8.04%，27例阳性病例中有26例为首次采集咽拭子和痰液标本核酸检测阳性，另1例为首次采集咽拭子和痰液标本核酸检测阴性，48小时后采集的第2份咽拭子和痰液标本核酸检测阳性；27例阳性病例中有19例为家庭聚集性病例。

2 新冠核酸检测阳性病例分布情况

2.1 年龄组分布：淮南市27例新型冠状病毒肺炎核酸检测阳性病例中最小年龄15岁，最大年龄78岁，年龄中位数为40岁，不同年龄核酸检测阳性分布情况见图1。

2.2 性别分布：27例核酸检测阳性病例中男性15例、占55.56%；女性12例、占44.44%，男女比例为1.25:1。

2.3 发病时间与检测阳性率：核酸检测阳性病例数主要集中在发病1～14天，阳性率为92.59%，核酸检测阳性平均发病时间为5天，淮南市新型冠状病毒疑似病例发病时间与核酸检测阳性病例关系见图2。

2.4 标本类型分布：336例新型冠状病毒疑似病例咽拭子和痰液标本核酸检测阳性情况见表1。咽拭子标本核酸检测阳性病例数为21例（6.25%），痰液标本核酸检测阳性病例数为25例（7.44%），经卡方检验分析χ2=0.373 4 ，P＞0.05，两者差异无统计学意义。

2.5 流行病调查：通过流行病调查分析，发病前14天内有武汉市及周边地区接触史或与新冠病毒感染者（核酸检测阳性者）有接触史的有25人。

2.6 病例病情：淮南市27例新型冠状病毒核酸检测阳性病例病情发展为普通型26例、重型1例，截止3月2日，27例病例中通过有效治疗已出院病例23例，剩余4例病例病情基本稳定。

讨 论

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸检测是确诊COVID-19的金标准[7]，因此，及时、准确的进行新型冠状病毒核酸检测不仅为尽早采取隔离措施、进行及时有效治疗、阻止疫情进一步扩大发挥至关重要的作用，也为重新识别与患者密切接触、被隔离的大量观察者提供科学依据，节省宝贵的医疗资源。针对SARS-CoV-2核酸检测，目前已有多家公司开发出针对ORF1ab、N基因的实时荧光定量PCR检测试剂，选择质量可靠，有保证的检测试剂非常重要。

核酸检测具有早期、敏感、易操作、特异性高等优势，但对于核酸检测结果的准确性需要从样本类型、样本质量、实验因素、试剂盒性能及患者感染周期等影响因素来综合分析[9]。新型冠状病毒肺炎疫情属于突发公共卫生事件，实验室检测操作人员应在生物安全防护下严格遵循标准操作流程、严格质量控制，避免由于操作原因引起的假阴性、假阳性结果，正确认识和看待检测结果。

本研究27例病例中有19例为家庭聚集性病例，其中有夫妻关系、母女关系、父子关系、兄妹关系等，他们之间有过近距离接触或长时间生活在一起，存在因密切接触导致的人际传播，或因共同暴露而感染，可见新型冠状病毒肺炎传染性很强，普通人群易感，有明显的人传染人现象，与钱扬会、Li Q等[10,11]报道相一致。

综合淮南市336例新型冠状病毒疑似病例核酸检测27例阳性病例年龄、性别分布来看，淮南市27例新型冠状病毒核酸检测阳性病例中最小年龄15岁，最大年龄78岁，中位数为40岁，年龄分布在31岁～60岁人群为17例（62.96%），与相关文献[12]研究结果接近。27例核酸检测阳性病例中男性15例（55.56%）；女性12例（44.44%）；另据中国疾病预防控制中心新型冠状病毒肺炎应急响应机制流行病学组[13]的研究，截止2月11日全国72 314例确诊病例中，男女比例为1.06∶1。本研究确诊组患者男女比为1.25∶1，比全国的数据略高、比安徽省阜阳市[14]的1.4∶1数据略低。这可能是因为地市级新型冠状病毒确证病例数较少，有一定局限性。至于27例病例多为31～60岁男性，可能由于这部分人群工作、生活在外居多，交际广泛，与各行各业外来人员接触的机会较多，致感染机会增加有关。

淮南市27例核酸检测阳性病例数主要集中在发病1～14天，阳性率92.59%，说明新型冠状病毒发病早期进行实验室核酸检测尤为重要。根据国家卫生健康委办公厅《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》[5]各级各类医疗机构的医务人员发现符合病例定义的疑似病例后，应立即采集疑似病例标本进行核酸检测，并尽快在具备有效隔离条件和防护条件的定点医院隔离治疗。因此新型冠状病毒疑似病例应早发现，早隔离，及时诊断，对症治疗，对防止病毒继续扩散、提高治愈效果非常重要。

本研究对336例新型冠状病毒肺炎疑似病例同时采集咽拭子和痰液标本进行实验室核酸检测，336例新型冠状病毒疑似病例核酸检测结果中，痰液标本检测阳性率大于咽拭子标本检测阳性率；但二者差异没有统计学意义，这可能是淮南市新型冠状病毒肺炎确诊组病例数较少的原因。27例阳性病例咽拭子标本和痰液标本核酸检测结果同时阳性的19例中，痰液标本核酸检测的CT值低于咽拭子标本核酸检测CT值的为15例，咽拭子标本未检出，而痰液标本检出新型冠状病毒核酸为6例，从27例检测结果看痰液标本的病毒含量高于咽拭子标本，痰液标本的检测效果优于咽拭子。受病毒感染机制影响，不同组织来源的SARSCoV-2载荷差异较大；而研究显示SARS-CoV-2更趋向于结合肺泡上皮细胞，侵袭感染下呼吸道细胞而产生咳嗽、肺炎等临床表现，理论上来说其下呼吸道标本比上呼吸道标本病毒阳性检出率更高[15]，与本研究结果相符。因此从27例核酸检测阳性结果来看，应当尽量按照新型冠状病毒肺炎防控方案要求同时规范采集病例发病早期咽拭子及深咳痰液并及时送检，以此提高标本核酸检测阳性率[7]，有利于对淮南市新型冠状病毒肺炎病例进行早期诊断；本研究结果也提示在新型冠状病毒肺炎病例实验室诊断及出院实验室诊断时不能以咽拭子病毒核酸检测阴性作为排除感染及治愈标准，而需同时检测病人咽拭子和深咳痰液标本进行综合判断，了解新型冠状病毒在咽拭子和痰液不同标本中的病毒含量及存在时间是实验室诊断新型冠状病毒肺炎病例以及判断病例治愈的重要环节。当前疫情防控措施需要增加新冠防控知识及爱国卫生运动宣传力度，加强个人卫生管理及人员密集的密闭公共场所的环境消毒工作，对于控制疫情具有非常重要作用。

淮南市新型冠状病毒核酸检测阳性27例病例集中收治在淮南市传染病医院，按照《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第五版）》及《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》临床分型，病情发展为普通型26例，重型1例，重症病例及时转入安徽省立医院感染病院救治；淮南市传染病医院根据普通型26例病人的呼吸道症状及影像学特征，进行对症治疗，截止3月2日已出院病例22例，这22例出院病例年龄均处于15～56岁，平时无基础疾病，这可能与病人本身体质较好，机体免疫应答能力较强有关；1例重症病例救治有效，于3月2日符合出院标准从安徽省立医院感染病院出院，剩余4例病人病情基本稳定，继续接受对症治疗。

鉴于新型冠状病毒肺炎传染性强，淮南市新型冠状病毒核酸检测阳性病例数多以聚集性病例为主，核酸检测工作仍需要加强和完善：①建立高质量管理体系包括生物安全管理体系，加强核酸检测实验室内部管理及检测技术的管理，从标本采集、保存、运送、检测整个过程规范管理，严格按照新型冠状病毒防控最新方案开展各项工作，进一步提高新型冠状病毒疑似病例的实验室诊断率，进一步提高检测敏感性、准确性、及时性；②加强实验室技术人员与流行病学工作人员、临床医师之间的交流，及时准确发现新型冠状病毒肺炎疑似病例，及早进行个案调查并采取有效措施，使疫情能得到及早控制；③完善实验室检测方法，尽快把核酸检测技术与IgM、IgG抗体、抗原快速检测方法有机结合，使得检测技术互相补充，为疫情趋势研判提供科学依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突