一测多评法测定栀榆洗剂中4 个组分含量

许 庆，安艳苏，毕秋左

（云南省曲靖市食品药品检验检测中心，云南 曲靖 655000）

中药临床验方形成的医院制剂具有“多成分、多靶向、君臣佐使协同作用”的特点，仅利用单一成分或指标性成分对其进行分析，难以实现对某味药材或制剂整体质量的控制，需要建立良好的多指标质量控制评价模式［1］，但中药制剂进行多组分定量测定时，所需对照品短缺、价格昂贵，又制约了这一发展趋势。一测多评（QAMS）法采用只测定药材或制剂中某个代表性成分（易得、价廉、有效），同时又可计算其他待测成分的含量，可有效克服对照品短缺这一问题，还能对药材或制剂进行多指标质量控制［2-12］。栀榆洗剂是曲靖市中医院的验方制剂，由栀子、地榆、马齿苋、苦参、大黄、白鲜皮、地肤子莶草、荆芥、防风、白矾11 种中药组方，具有清热解毒凉血、祛风燥湿止痒功效，临床主要用于治疗湿疹、银屑病、各种皮炎。皮肤病复杂且易反复发作，故栀榆洗剂处方中采用君臣佐使协同配伍，临床疗效确切。但现行质量标准较简单，未采用定量方法对制剂进行质量控制。本研究中分别选取地榆（君药）中没食子酸，栀子和大黄（臣药）中栀子苷、大黄酸、没食子酸，防风（佐药）中升麻素苷为指标成分，参照文献［13-14］，建立了高效液相色谱（HPLC）法，以栀子苷为内标物，计算出其余组分的相对校正因子，并考察方法的耐用性及系统适用性，以验证QAMS 法在栀榆洗剂多指标质量控制中应用的可行性。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260 型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司，检测器为DAD）；岛津20AD 型高效液相色谱仪（日本岛津公司，检测器为DAD）；XPR2003SC 型梅特勒电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，双量程0.1 mg /0.01 mg）；HHS226 型恒温水浴锅（江苏省医疗器械厂）；密理博超纯水机（美国密理博公司）。

1.2 试药

栀子苷对照品（批号为110749-201919，含量以97.1%计），升麻素苷对照品（批号为111522-201712，含量以96.2%计），没食子酸对照品（批号为110831-201605，含量以90.8% 计），大黄酸对照品（批号为110757-201607，含量以99.3%计），均由中国食品药品检定研究院提供；甲醇（色谱纯，默克股份两合公司，批号为11046707936）；磷酸（优级纯，成都市科隆化学品有限公司，批号为201703241）；栀榆洗剂（批号分别为 SC2018002，SC2018003，SC2019001，SC2019002，SC2019003，SC2019004），缺栀子、缺防风、缺大黄、缺地榆-大黄（缺没食子酸）阴性对照品均由曲靖市中医院制剂室提供。

2 方法与结果

2.1 QAMS 方法学考察

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0 ～11 min 时5%A，11 ～15 min 时5%A→30%A，15 ～60 min 时30%A，60 ～65 min 时30%A→70%A，65 ～80 min 时70%A，80 ～81 min 时5%A，81 ～91 min时5%A）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：238 nm；进样量：5 μL。

2.1.2 溶液制备

取栀子苷、没食子酸、升麻素苷、大黄酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为201.97，562.05，38.48，23.28 μg/mL 的混合对照品溶液。精密量取上述溶液各10 mL，置具塞锥形瓶中，于水浴上蒸干，精密加入甲醇10 mL，密塞，称定质量，水浴回流1.5 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取缺栀子、缺防风、缺大黄、缺地榆-大黄（缺没食子酸）阴性对照品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

专属性试验：精密吸取上述3 种溶液各5 μL，进样分析。结果各成分与邻峰的分离度均大于1.5，理论板数按栀子苷峰计在3 000 以上。阴性对照品溶液在与栀子苷、升麻素苷、大黄酸、没食子酸峰相同保留时间处无相应色谱峰，阴性对照无干扰。结果见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密吸取上述混合对照品溶液1，2，3，4，5，6 μL，注入色谱仪，按拟订色谱条件进样测定，以进样量（X）对峰面积（Y）进行线性回归，得栀子苷、没食子酸、升麻素苷、大黄酸的标准曲线方程。结果见表1，表明各化合物进样量在相应范围内与峰面积线性关系良好。

表1 4 种成分的线性关系考察结果（ n=6）

精密度试验：精密吸取2.1.2 项下混合对照品溶液2 μL，连续进样6 次，记录各组分峰面积。结果峰面积的RSD分别为0.81%，0.92%，0.56%，1.11%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为SC2018003），依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h 时进样测定。结果栀子苷、没食子酸、升麻素苷、大黄酸峰面积的RSD分别为0.73%，0.94%，1.23%，1.01%（n=6），表明供试品溶液在24 h 内稳定。

重复性试验：精密量取样品（批号为SC2018003）10mL，共5 份，依法制备供试品溶液，进样测定。结果栀子苷、没食子酸、升麻素苷、大黄酸的含量分别为81.78，225.64，13.10，7.33 μg/mL，RSD分 别 为0.58% ，0.82%，1.16%，1.33%（n=5）。

加样回收试验：精密量取同一批（批号为SC2018003）已知含量的样品5 mL，共6 份，分别置具塞锥形瓶中，精密加入质量浓度栀子苷为420.2 μg/mL、没食子酸为1 128.7 μg/mL、升麻素苷为67.1 μg/mL、大黄酸为36.8 μg/mL 的混合对照品溶液1 mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，并计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）

2.1.4 相对校正因子计算

参照文献［2，7］，以混合对照品溶液多个浓度点分别进样，计算所得相对校正因子的平均值fkm。本试验中以栀子苷为内标物，按公式fkm=fk/fm=Wk×Am/Wm×Ak（式中Wk为内标物浓度，Wm为其他待测组分浓度，Am为其他待测组分峰面积，Ak为内标物峰面积）分别计算3 种待测组分与栀子苷的fkm，结果见表3。

表3 栀子苷对没食子酸、升麻素苷、大黄酸的相对校正因子

2.2 相对校正因子重复性考察

取2.1.2 项下混合对照品溶液，分别进样1.0，1.5，3.0，4.0，5.0，6.0 μL，按2.1.4 项下公式计算栀子苷对没食子酸、升麻素苷、大黄酸的相对校正因子。考察了2 台不同型号的高效液相色谱系统（Agilent1260 型及岛津20AD 型）及3 种色谱柱［Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），依利特Hypersil ODS2 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Thermo Hypersil GOLD C18柱（250mm×4.6mm，5μm）］，柱间相对校正因子的RSD＜1%，表明相对校正因子在不同仪器和色谱柱上的耐用性均较好。详见表4。

表4 不同色谱柱和仪器测得相对校正因子

2.3 待测组分色谱峰定位

表5 不同仪器及规格色谱柱下目标成分的相对保留时间

通过相对保留时间进行待测组分峰的定位，结果见表5。可见，各待测组分相对保留值的RSD＜3.0 %，根据不同仪器及规格色谱柱下目标成分的相对保留时间可正确判断目标峰的准确位置。

表6 ESM 法和QAMS 法测定栀榆洗剂中4 种成分含量比较（μg/mL，n=6）

2.4 QAMS 法与外标（ESM）法测定结果比较

精密吸取供试品溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪测定，采用QAMS 法与ESM 法计算样品中栀子苷、没食子酸、升麻素苷、大黄酸的含量。结果见表6。采用统计软件计算2 种方法的没食子酸、升麻素苷、大黄酸含量之间的Pearson 系数。结果表明，2 种方法所测得含量相似度较高；两组含量的RSD均在2%内，表明2 种方法测得各批次样品的含量无显著差异，QAMS 法可应用于栀榆洗剂各组分的含量测定。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择

供试品溶液提取时考察了甲醇超声提取与水浴回流提取2 种方法，发现后者提取率更高，故选择后者。水浴回流提取0.5，1.0，1.5，2.0 h，结果1.5 h 后含量提取变化不大，故采取甲醇水浴回流1.5 h，制剂中4 个组分提取效率高，分离度好，杂质干扰峰较少，方法简单易行。

3.2 检测波长选择

对栀子苷、没食子酸、升麻素苷、大黄酸进行全波长扫描，在238 nm 和254 nm 波长处均有吸收，并比较238 nm 和254 nm 波长下的色谱图，结果238 nm波长处各主成分峰灵敏度高、干扰较少，被选为检测波长。

3.3 校正因子考察

为验证所建立4 个组分QAMS 法的适用性及可行性，本研究中进行了方法学考察及系统适用性试验。通过2 台液相色谱仪、3 根不同品牌及型号色谱柱的考察，结果表明没食子酸、升麻素苷、大黄酸与栀子苷之间的相对校正因子具有良好的重复性。

3.4 方法评价

本研究中建立的QAMS 法应用于栀榆洗剂的质量评价，以栀子苷为内标物，分别确定没食子酸、升麻素苷、大黄酸的相对校正因子，分别采用ESM 法和QAMS法测定4 种成分的含量，并通过RSD和Pearson 系数比较两者的相对误差。QAMS 法所得4 种成分的含量与传统ESM 法测得结果无显著差异，且与ESM 法相比，可节约检测成本，有利于制剂的质量控制，可为医院制剂多成分定量分析提供参考。