结直肠癌肝转移患者射频消融术后小核仁RNA宿主基因15变化及意义

郭新宇，田鹏，张鹏，刘毅，刘健康

河南省人民医院普外科，郑州 450000

近年来，中国结直肠癌发病率逐年升高，严重影响人们的身体健康[1]。肝脏是结直肠癌远处转移最为常见的器官[2]。相关研究表明，结直肠癌肝转移后无治疗生存期约5～12个月[3]，即使接受根治性切除术治疗，仍有50%的患者因其他部位转移或复发而死亡[4]。此外，结直肠癌患者发生多处转移，很难通过根治性手术彻底切除。射频消融术具有微创、安全及效果明显等特点，已被广泛应用于临床实体肿瘤治疗[5]。研究显示，实体肿瘤患者经射频消融术治疗后恢复较快，且并无严重不良反应及并发症[6]。目前，与根治性切除术相比，越来越多的肝癌、非小细胞肺癌等实体瘤患者更倾向于选择射频消融术治疗。虽然射频消融术可在一定程度上根治肿瘤，但仍有部分患者出现了复发或转移，最终死亡[7]。因此，及时了解结直肠癌肝转移患者预后情况对后续治疗意义重大，但目前缺乏灵敏度和特异度均较高的生物标志物。

长链非编码RNA（long chain non-coding RNA，lncRNA）是一类调控基因表达的不编码蛋白质的RNA[8]。随着测序技术和生物信息学的飞速发展，越来越多的lncRNA被证实与人体疾病有关。多项研究证实，HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）、母系印记表达基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）和小核仁RNA宿主基因15（small nucleolar RNA host gene 15，SNHG15）等多个lncRNA参与了肿瘤的发生和发展过程[9-12]。SNHG15可转录8种小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）。本研究通过比较治疗前后血清SNHG15相对表达量的变化，分析其与患者预后的关系，以期为结直肠癌肝转移患者射频消融术治疗的预后评估提供参考，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2014年3月至2016年4月河南省人民医院收治的58例结直肠癌肝转移患者。纳入标准：①原发肿瘤为结直肠癌，并经影像及病理学等检查确诊为肝转移；②接受射频消融术治疗。排除标准：①接受放、化疗、靶向治疗、免疫治疗及根治性手术治疗等；②发生肝转移以外的其他组织转移；③合并自身免疫性疾病或血液系统疾病等；④临床资料不完整。58例结直肠癌肝转移患者中男42例，女16例；平均肿瘤直径为（3.18±0.44）cm；肿瘤数目：单发43例，多发15例（2～3个，共计75个肝转移瘤）；血管侵犯20例，无血管侵犯38例。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 射频消融术 术前检测患者血常规、血生化、凝血时间等。术中监测患者的血氧饱和度、血压、脉搏和心率等。患者平卧，消毒，铺巾，1%利多卡因进行局部麻醉。在计算机断层扫描（CT）引导下将射频消融针穿刺至肿瘤中央，选择适宜射频电压进行治疗。治疗后，观察肿瘤是否完全消融，若肿瘤完全消融，调节为凝固模式，烧灼针道。术后给予镇痛、抗感染及其他对症治疗等。

1.2.2 定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法检测血清SNHG15miRNA 的相对表达量 抽取结直肠癌肝转移患者肘部静脉血10 ml，3500 r/min，离心15 min，提取上层清液于离心管中，低温保存，待验。将Trizol试剂加入提取的血清中提取血清总RNA，若A260/A280为1.8～2.0，继续后续实验；提取总RNA，用逆转录试剂盒合成互补DNA（complementary DNA，cDNA），依据试剂盒说明书进行PCR扩增，反应条件：95 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，退火15 s，72 ℃ 45 s，40个循环。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct计算SNHG15miRNA的相对表达量。SNHG15正向引物 5'-GGTGACGGTCTCAAAGTGGA-3'，反向引物 5'-CAGAGTTGGGGTCTCTGCAA-3'；GAPDH正向引物5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，反向引物5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。

1.2.3 随访方法 采用复诊、住院观察及电话随访等方式于出院后1个月对患者开始随访，每月随访1次，随访4～36个月。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对所有数据进行统计分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对t检验；结直肠癌肝转移患者预后的影响因素采用Cox多因素分析；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线及曲线下面积（area under curve，AUC）评估SNHG15对结直肠癌肝转移患者预后的诊断效能；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率的比较采用Log-rank检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNHG15miRNA 相对表达量的比较

射频消融术治疗前，结直肠癌肝转移患者血清SNHG15miRNA的相对表达量为（2.86±0.67），明显高于射频消融术治疗后结直肠癌肝转移患者血清SNHG15miRNA的相对表达量（1.77±0.45），差异有统计学意义（t=11.604，P＜0.01）。

2.2 预后情况的比较

58例结直肠癌肝转移患者1、2和3年的生存率分别为91.38%（53/58）、68.97%（40/58）和62.07%（36/58）。

2.3 SNHG15对结直肠癌肝转移患者预后的诊断价值

经射频消融术治疗3年后，结直肠癌肝转移患者生存36例，死亡22例，分别作为生存组和死亡组。生存组患者血清SNHG15miRNA相对表达量为（1.52±0.34），明显低于死亡组患者的（2.17±0.30），差异有统计学意义（t=7.343，P＜0.01）。血清SNHG15诊断结直肠癌肝转移患者预后的AUC为 0.924（95% CI：0.823～0.977），约登指数为0.722，其所对应的最佳截断点、灵敏度和特异度分别为1.78、100.00%和72.22%。（图1）

图1 血清SNHG15诊断结直肠癌肝转移患者预后的ROC曲线

2.4 SNHG15miRNA 相对表达量与结直肠癌肝转移患者3年预后的关系

以SNHG15miRNA相对表达量为1.78为临界值，SNHG15miRNA相对表达量＞1.78结直肠癌肝转移患者（n=40）的平均总生存时间为18.61个月（95% CI：14.24～22.98个月），低于SNHG15miRNA相对表达量≤1.78结直肠癌肝转移患者（n=18）的平均总生存时间34.10个月（95% CI：32.47～35.73个月），差异有统计学意义（χ2=37.107，P＜0.05）。（图2）

图2 SNHG15miRNA相对表达量＞1.78（n=40）与SNHG15 miRNA相对表达量≤1.78（n=18）结直肠癌肝转移患者的生存曲线

2.5 结直肠癌肝转移患者预后影响因素的单因素和多因素分析

将可能影响结直肠癌肝转移患者预后的相关因素，如年龄、性别、肿瘤直径、甲胎蛋白（α-fetal protein，AFP）水平、Child-Pugh分级、分化程度、肿瘤数目、血管侵犯情况及SNHG15miRNA相对表达量作为自变量，结直肠癌肝转移患者的总生存时间作为因变量纳入Cox单因素分析，结果显示，AFP水平、分化程度、血管侵犯情况及SNHG15miRNA相对表达量可能与结直肠癌肝转移患者的预后相关。将AFP水平、分化程度、血管侵犯情况及SNHG15miRNA相对表达量作为自变量，结直肠癌肝转移患者的总生存时间作为因变量纳入Cox多因素分析，结果显示，血管侵犯情况和SNHG15miRNA相对表达量与结直肠癌肝转移患者总生存时间密切相关。（表1）

表1 结直肠癌肝转移患者预后影响因素的Cox单因素和多因素分析

3 讨论

SNHG15位于7p13染色体[13]，已被证实参与多种肿瘤的发生发展过程，如胃癌、骨肉瘤等[14-15]。近年来，越来越多的lncRNA被证实与肿瘤临床病理特征及预后有关[16-19]。研究显示，胃癌患者SNHG15高表达，且与患者不良预后密切相关[20]。但关于SNHG15在结直肠癌肝转移患者中的表达情况，是否与结直肠癌肝转移患者预后相关仍不得而知。为此，本研究采用定量RT-PCR法检测了结直肠癌肝转移患者血清SNHG15的相对表达量，分析其与患者预后的关系。

本研究结果显示，射频消融术治疗前，结直肠癌肝转移患者血清SNHG15miRNA的相对表达量高于治疗后血清SNHG15miRNA的相对表达量，表明SNHG15可能与肝转移瘤有关。本研究通过对58例结直肠癌肝转移患者进行跟踪随访，了解其生存预后情况，并比较了不同预后患者血清SNHG15miRNA的相对表达量，结果发现，经射频消融术治疗后，生存组结直肠癌肝转移患者血清SNHG15miRNA的相对表达量低于死亡组患者，推测SNHG15miRNA的相对表达量可能对评估结直肠癌肝转移患者的预后具有重要价值。为验证上述推断，本研究采用ROC曲线评估SNHG15对结直肠癌肝转移患者预后的诊断效能，结果发现，SNHG15miRNA的相对表达量诊断结直肠癌肝转移患者预后的AUC为0.924，表明SNHG15诊断结直肠癌肝转移患者预后的效能较高，具有一定临床参考价值。此外，本研究还分析了不同SNHG15miRNA相对表达量的结直肠癌肝转移患者生存时间，结果显示，SNHG15miRNA相对表达量＞1.78的结直肠癌肝转移患者平均总生存时间为18.61个月，低于SNHG15miRNA相对表达量≤1.78的结直肠癌肝转移患者的平均总生存时间。上述结果表明SNHG15的相对表达量可能与结直肠癌肝转移患者的生存时间有关。本研究采用Cox单因素及多因素回归分析进一步探讨结直肠癌肝转移患者预后的影响因素，结果显示，血管侵犯情况和SNHG15miRNA相对表达量与结直肠癌肝转移患者总生存时间密切相关，SNHG15miRNA的相对表达量越高，结直肠癌肝转移患者预后死亡风险越高。

综上所述，结直肠癌肝转移患者射频消融术后SNHG15miRNA的相对表达量降低，其相对表达量与射频消融术治疗结直肠癌肝转移患者的预后密切相关，检测结直肠癌肝转移患者血清SNHG15miRNA的相对表达量有助于评估患者的生存预后，为肝转移瘤的靶向药物研制提供了方向。本文虽证实SNHG15miRNA的相对表达量与结直肠癌肝转移患者预后密切相关，但因样本量有限，仍需进行大样本、多中心研究，以避免样本量小、个体差异及抽样误差所造成实验结果的偶然性和随机性。