snoRNA87在原发性肝癌中的表达及意义

孙菲，张金仿，王克迪，苏建荣

首都医科大学附属北京友谊医院检验科，北京 100050

原发性肝癌是一种较为常见的消化系统恶性肿瘤，目前研究显示，生物学标志物诊断原发性肝癌的灵敏度和特异度均较低，不能对原发性肝癌做出准确诊断[1-2]。小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）是一种非编码RNA，是人类最早发现非编码RNA，snoRNA定位于细胞核。随着对snoRNA的不断探索和深入研究，目前已知的snoRNA多达400余种，认为snoRNA其基础作用和对核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）的修饰、功能的发挥有关[3-4]。研究认为，snoRNA与多种肿瘤的发生发展密切相关，并参与细胞周期调控，在细胞增殖中发挥重要作用，为研究调节细胞功能的相关机制提供新的研究方向[5-6]。因此，寻找诊断原发性肝癌的诊断价值较高的肿瘤标志物对患者尤为重要，本研究探讨snoRNA87在原发性肝癌患者肝癌组织中的表达及意义，为原发性肝癌的诊治提供新方向，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2014年1月至12月首都医科大学附属北京友谊医院收治的100例原发性肝癌患者。纳入标准：均经病理学诊断确诊为原发性肝癌，均接受原发性肝癌手术。排除标准：既往接受过化疗，合并其他肿瘤、精神障碍或其他严重内科疾病患者，妊娠期妇女。100例原发性肝癌患者中男53例，女47例；年龄35～75岁，＞50岁56例，≤50岁44例；肿块个数：1个53例，≥2个47例；肿瘤直径：＞5 cm 45例，≤5 cm 55例；合并肝硬化35例，未合并肝硬化65例；乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBⅤ）感染：乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）阳性（HBsAg+）42例，HBsAg-58例；分化程度：低分化10例，中分化36例，高分化54例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期68例，血清甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）浓度：＞200 ng/ml 29例，≤200 ng/ml 71例。取100例原发性肝癌患者的肝癌组织及对应的癌旁组织，多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片待检。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化法检测snoRNA87阳性表达情况将肝癌组织及癌旁组织标本置于二甲苯中脱蜡处理10 min，梯度乙醇水化；蛋白酶修复液37℃的恒温孵化30 min，弃抗原修复液；切片移入湿盒中加入浓度为3%的过氧化氢，去过氧化物酶封闭液，恒温冰箱孵育10 min，采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗；加入适量的山羊血清，室温环境下封闭30 min；用滤纸将封闭液吸取，加入一抗，放入湿盒，然后再加入二抗，室温孵育1 h，采用PBS冲洗；二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色处理10 min，显微镜下观察，依据着色强度和阳性细胞百分比计算snoRNA87阳性表达率。

1.2.2 荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）检测snoRNA87的相对表达量 依据试剂盒说明书提取总RNA，参照逆转录试剂盒操作说明，将RNA逆转录为cDNA，然后以cDNA为模板，进行PCR扩增：94℃ 3 min，94℃ 1 min，55℃1 min，72℃ 1 min，共35个循环，4℃环境中保存12 h。以U6为内参，采用 2-△△Ct法计算snoRNA87的相对表达量。snoRNA87上游引物：5'-ACCCAGCTGAGGTTGTCTTT-3'，下游引物 ：5'-GGTGGCTTATGTTTGTAATCCC-3'；U6上游引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下游引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。

1.2.3 随访方法 采用上门、电话回访及其他通讯方法对100例患者进行为期5年的随访，随访截止2019年1月。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对所有数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率的比较采Log-rank检验，以受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析各指标诊断效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 snoRNA87阳性表达率的比较

肝癌组织中snoRNA87的阳性表达率为91%（91/100），明显高于癌旁组织的14%（14/100），差异有统计学意义（χ2=118.877，P＜0.01）。

2.2 不同基线特征原发性肝癌患者肝癌组织中snoRNA87表达情况的比较

不同性别、年龄、肿瘤直径、肿块个数、肝硬化情况和HBⅤ感染情况原发性肝癌患者肝癌组织中snoRNA87阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同分化程度、TNM分期、血清AFP浓度原发性肝癌患者肝癌组织中snoRNA87阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

2.3 RT-PCR检测snoRNA87的相对表达量

将肝癌组织中snoRNA87相对表达量＞10.00的原发性肝癌患者作为高表达组（n=62），将肝癌组织中snoRNA87相对表达量≤10的原发性肝癌患者作为低表达组（n=38），结果显示，高表达组患者snoRNA87的相对表达量为（15.35±3.16），明显高于低表达组患者的（3.82±1.68），差异有统计学意义（t=19.081，P＜0.01）。

表1 不同基线特征原发性肝癌患者肝癌组织中snoRNA87表达情况的比较（n=100）

2.4 生存情况的比较

采用Kaplan-Meier绘制生存曲线，生存率的比较采Log-rank检验，同时比较高表达组和低表达组患者平均生存时间、中位无进展生存期（progress free survive，PFS）和总生 存期（overall survival，OS），结果显示，高表达组患者的5年生存率为14.52%（9/62），明显低于低表达组患者的42.11%（16/38），差异有统计学意义（χ2=9.564，P＜0.01）；高表达组患者的5年平均生存时间为（2.13±0.50）年，明显短于低表达组患者的（3.56±1.01）年，差异有统计学意义（t=9.439，P＜0.01）。高表达组患者的中位PFS为10.6个月，长于低表达组患者的4.5个月；中位OS为20.4个月，短于低表达组患者的32.2个月。

2.5 snoRNA87对原发性肝癌的诊断价值

snoRNA87诊断原发性肝癌的ROC曲线下面积（area under the curve，AUC）为 0.734（0.577～0.980），当截断值为38.12时，诊断灵敏度为93.12%，特异度为94.25%；当截断值为17.59时，诊断灵敏度为97.58%，特异度为91.32%。（图1）

图1 snoRNA87诊断原发性肝癌的ROC曲线

3 讨论

snoRNA是一种非编码RNA，是人类最早发现非编码RNA，主要定位在细胞核，在对微小RNA（micro RNA，miRNA）测序过程中发现，snoRNA在细胞内可经过切割形成不同长度的RNA片段，且部分snoRNA结构和功能与miRNA相同，生理状态下，这部分具有miRNA结构和功能的snoRNA在细胞核内可同时发挥其自身功能和miRNA功能。目前研究发现，部分snoRNA可参与肿瘤发生和发展[7-8]。但目前snoRNA与原发性肝癌的关系的研究报道较少，因此，本研究探讨snoRNA87在原发性肝癌患者肝癌组织中的表达及意义，为临床上原发性肝癌的诊断提供新方向。

目前，临床根据基因序列、结构、结合蛋白组分、修饰rRNA的功能不同，可将snoRNA分为boxC/D snoRNA、boxH/ACA snoRNA、孤儿型snoRNA、特异性小卡扎尔体snoRNA，但目前研究最为广泛的为boxC/D snoRNA和boxH/ACA snoRNA[9-11]。张燕等[12]对snoRNA及其衍生RNA的研究进展进行分析，结果显示，snoRNA在正常细胞功能中发挥重要作用，其可在细胞核、细胞质中同时存在，但处于不同位置的snoRNA功能、转运机制仍不明确，还需进一步研究发现。国内外有大量研究认为，snoRNA与多种肿瘤的发生发展有关，并参与调控细胞周期，在细胞增殖中发挥重要作用，为研究调节细胞功能的相关机制提供新的研究方向[13-16]。本研究结果显示，肝癌组织中snoRNA87的阳性表达率为91%，明显高于癌旁组织的14%，且snoRNA87的表达可能与原发性肝癌患者的分化程度、TNM分期、血清AFP浓度有关，表明snoRNA87在原发性肝癌患者肝癌组织中表达水平较高，且可能与患者肿瘤分化程度、TNM分期、血清AFP浓度相关，参与原发性肝癌的发生与发展。研究结果显示，snoRNA参与多种肿瘤的发生发展，可作为肿瘤诊断的特异性指标[17-20]。本研究对100例原发性肝癌患者进行为期5年的随访，结果显示，高表达组患者的5年生存率为14.52%，明显低于低表达组患者的42.11%，差异有统计学意义（P＜0.01），且snoRNA87对原发性肝癌的诊断灵敏度、特异度均较高，表明snoRNA87对原发性肝癌的诊断价值较高且可对患者的预后生存周期进行评价，但目前尚未有关于原发性肝癌患者肝癌组织中snoRNA87高表达与肿瘤发生发展关系的研究，尚需进一步深入研究。

综上所述，snoRNA87在原发性肝癌患者肝癌组织中阳性表达率较高，且可能与原发性肝癌患者的分化程度、TNM分期和血清AFP浓度有关，对原发性肝癌的诊断价值较高。