microRNA-214在胃癌组织中的表达情况及临床意义

谢良宝，高凌，冯亚光，张玉文

商丘市第一人民医院1胃肠肝胆外科，2病理科，河南 商丘 476100

胃癌是临床常见的胃肠道恶性肿瘤，在中国，其在胃肠道恶性肿瘤中的发病率位居首位，严重威胁患者的生活质量和生命健康[1]。近年来，随着医疗技术的发展，胃癌的治疗取得了一定的进展，但胃癌患者的总体治疗效果及预后仍较差[2]。胃癌的发生可能与地域、环境、生活习惯、幽门螺杆菌感染、癌前病变、遗传和基因等因素有关，患者发病初期通常无特异性临床表现，部分患者存在恶心、呕吐等症状，早期胃癌的诊断较为困难[3]。截至目前，胃癌的具体发病原因及发病机制仍未明确，因此，临床中针对胃癌早期预防和治疗的方案尚无法确定。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年来新发现的一类小分子非编码RNA，其在肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化和周期调控等过程中具有重要意义[4]。miRNA-214的特异性表达与多种肿瘤的发生、发展有密切联系[5]，但关于其在胃癌中表达情况的研究鲜有报道。本研究探讨miRNA-214在胃癌组织及相应癌旁组织中的表达情况与其胃癌患者临床特征的关系，以期为胃癌的临床诊治提供新的思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年5月至2013年5月于商丘市第一人民医院接受胃癌根治术的胃癌患者。纳入标准：①经病理学检查确诊为胃腺癌；②术前无放疗或化疗等抗肿瘤治疗史；③具备手术治疗指征。排除标准：①合并其他脏器转移；②合并心、肺、肝、肾等重要脏器功能不全；③合并其他部位恶性肿瘤；④临床资料不完整或术后失访。根据纳入、排除标准，共纳入47例胃癌患者，其中，男26例，女21例；年龄37～80岁，平均年龄（51.8±7.4）岁；TNM分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期10例，Ⅲ期12例，Ⅳ期12例；分化程度：高分化14例，中分化17例，低分化16例；肿瘤直径＞4 cm 25例，肿瘤直径≤4 cm 22例；淋巴结转移23例，无淋巴结转移24例。收集47例胃癌患者的胃癌组织标本及相应的癌旁（距肿瘤边缘≥5 cm）组织标本进行研究。

1.2 主要试剂和仪器

Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，胎牛血清购自杭州吉诺生物医药技术公司，逆转录试剂盒购自美国Promega公司，实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒购自日本Takara公司，ABI7500型qRT-PCR仪购自美国PE公司。

1.3 组织RNA 提取

将胃癌组织和癌旁组织进行切片，厚度为3 mm，取5 cm2大小的组织置入试管中，加入500 μl Trizol组织裂解液，剧烈振荡30 s制成混悬液，置入1.5 ml RNase free EP管，室温静置2 min后加入200 μl氯仿，振荡器振荡20 s，室温静置5 min后离心处理，离心速度为10 000 r/min，离心25 min，后取上清液2 ml于EP管，加入异丙醇2 ml，混匀后离心25 min，离心速度为10 000 r/min，弃上清液。然后加入70%乙醇于EP管中，离心1 min，离心速度为10 000 r/min，弃上清液，沉淀RNA20 min，待乙醇挥发后，采用RNA试剂盒提取总RNA，严格按照试剂盒说明书的操作步骤进行操作。

1.4 qRT-PCR检测miRNA-214的相对表达量

采用qRT-PCR反转录试剂盒将总RNA进行逆转录反应，将RNA加水稀释至2 ng/μl，加入逆转录溶液，RNA逆转录为cDNA的反应条件为16℃持续60 min，42 ℃持续30 min，85 ℃持续10 min；将剩余RNA产物置于-20℃环境下保存。反应结束后对cDNA产物进行冷却处理并常规稀释，稀释比例为 1∶400，取 2 μl样本作为 PCR 定量检测的模板，于ABI7500实时定量PCR反应仪上进行PCR反应。采用2-ΔΔCt法计算胃癌组织和癌旁组织中miRNA-214的相对表达量。

1.5 观察指标及随访

观察并比较胃癌组织及癌旁组织中miRNA-214的相对表达量，分析胃癌组织中miRNA-214的表达情况与胃癌患者临床特征的关系，并分析胃癌患者预后的影响因素。嘱所有患者于术后1年内每3个月、术后1～3年内每6个月行门诊复查，通过腹部计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）和血液学指标等综合判断患者的术后复发或转移情况，记录所有患者的术后无瘤生存情况。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；采用Kaplan-Merier法绘制生存曲线；采用Cox比例风险回归模型对胃癌患者预后的影响因素进行单因素和多因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织和癌旁组织中miRNA-214的相对表达量

qRT-PCR检测结果显示，胃癌患者胃癌组织中miRNA-214的相对表达量为（4.69±0.53），明显高于癌旁组织的（3.04±0.36），差异有统计学意义（t=25.15，P＜0.01）。

2.2 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中miRNA-214的相对表达量

不同TNM分期、分化程度、淋巴结转移情况的胃癌患者胃癌组织中miRNA-214的相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同性别、年龄、肿瘤直径的胃癌患者胃癌组织中miRNA-214的相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

2.3 miRNA-214表达与胃癌患者预后的关系

胃癌患者的1年无瘤生存率为85.11%（40/47），3年无瘤生存率为48.94%（23/47），中位无瘤生存时间为23个月。3年无瘤生存的23例胃癌患者胃癌组织中miRNA-214的相对表达量为（4.02±0.48），3年复发或转移的24例患者胃癌组织中miRNA-214相对表达量为（5.34±0.43），差异有统计学意义（t=9.939，P＜0.05）。

2.4 胃癌患者预后影响因素的Cox 比例风险回归分析

根据47例胃癌患者胃癌组织中miRNA-214相对表达量的平均值4.69，将患者分为miRNA-214高表达（miRNA-214≥4.69）患者25例和miRNA-214低表达（miRNA-214＜4.69）患者22例。以性别、年龄、肿瘤直径、TNM分期、分化程度、淋巴结转移情况和miRNA-214表达为自变量，以患者的3年无瘤生存为因变量，采用Cox比例风险回归模型进行单因素和多因素分析，结果显示，miRNA-214高表达、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移和低分化均是胃癌患者3年无瘤生存的独立危险因素（P＜0.05）。（表2、表3）

表2 47例胃癌患者3年无瘤生存影响因素的Cox单因素分析

表3 47例胃癌患者3年无瘤生存影响因素的Cox多因素分析

3 讨论

胃癌具有发病率高、早期诊断率低和复发率高的特点，早期诊断和治疗可改善胃癌患者的预后。因此，寻找灵敏度和特异度较高的肿瘤标志物对胃癌的诊断具有重要意义。研究表明，miRNA在多种肿瘤组织中均有特异性的表达谱，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化、迁移和侵袭等多种生物学行为[6-8]。miRNA的过表达可能对肿瘤细胞的生长、增殖具有一定的促进作用，从而促进肿瘤进展。也有研究指出，miRNA可能具有促进肿瘤发生与抑制肿瘤发生的作用[9-10]。miRNA的异常调控通常伴随着基因表观遗传学上的改变，如基因的缺失、突变以及DNA甲基化水平的异常改变等，而这些变化与肿瘤的发生、发展及预后均密切相关。miRNA-214是miRNA中的重要组成分子，在不同恶性肿瘤中的表达水平存在差异。也有研究发现，miRNA-214在宫颈癌组织中的表达水平低于正常宫颈组织（P＜0.05），分析出现这一结果的原因可能是miRNA-214通过抑制其靶基因腺苷二磷酸-核糖基化样因子2的表达从而抑制了宫颈癌的生长和侵袭[11]；此外，miRNA-214在胰腺癌、肝癌等多种肿瘤细胞中的表达上调[12-14]，其可能成为肿瘤早期诊断及预后预测的重要生物标志分子。

本研究发现，胃癌患者胃癌组织中miRNA-214的相对表达量明显高于癌旁组织（P＜0.01），提示miRNA-214在胃癌的发生、发展过程中发挥重要作用。miRNA-214的过表达对多种细胞表面分子的表达具有促进作用，从而促进肿瘤细胞的迁移、侵袭及转移。周晓刚等[15]检测了胃癌组织和癌旁正常胃组织中miRNA-214和PTEN蛋白的表达水平，结果发现，miRNA-214通过上调PTEN蛋白的表达从而影响胃癌细胞的增殖与侵袭。本研究比较了不同临床特征胃癌患者胃癌组织中miRNA-214的相对表达量，结果显示，不同TNM分期、分化程度、淋巴结转移情况的胃癌患者胃癌组织中miRNA-214的相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同性别、年龄、肿瘤直径的胃癌患者胃癌组织中miRNA-214的相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），表明miRNA-214在胃癌组织中的相对表达量与胃癌的进展可能有关。陈琳等[16]采用实时荧光定量PCR法检测56例胃癌患者血浆中miRNA-214的表达情况，并分析了临床分期与miRNA-214表达情况的关系，结果发现，miRNA-214的表达与胃癌患者的临床分期和生存时间均有关，提示miRNA-214可能能够作为评估胃癌患者预后的靶基因，这与本研究结果一致。本研究中，Cox多因素回归分析结果显示，miRNA-214高表达、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移和低分化均是胃癌患者3年无瘤生存的独立危险因素。然而，由于多种原因，本研究对miRNA-214在胃癌发生、发展过程中的作用及分子机制的研究不够深入。有研究报道，miRNA-214能够促进胃癌细胞的侵袭与转移，其机制可能与PTEN的表达下调有关[17]。但是，miRNA-214在不同恶性肿瘤中的表达水平不同，提示miRNA-214在不同肿瘤中的差异性表达是通过调控某种癌基因或抑癌基因从而实现对肿瘤细胞生长的促进或抑制作用[18]。因此，关于miRNA-214在胃癌中的作用机制有待进一步深入研究。

综上所述，miRNA-214在胃癌组织中呈相对高表达，且miRNA-214高表达、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移和低分化均是胃癌患者3年无瘤生存的独立危险因素。