石斛灌胃对非酒精性脂肪肝小鼠肝细胞内脂肪过度沉积的改善作用及其机制

梁钰华，杨育辉，邓晓冬，林成创

1 广州市番禺区中心医院，广州511400；2 广州中医药大学数理工程研究院

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是指无长期且大量酒精损伤以及其他明确的肝损伤因素所导致的肝细胞内脂肪过度沉积[1]，肝小叶是其病变的主要部位，一般常以慢性良性过程为主，严重时会发生肝脏及全身性并发症。随着NAFLD的发病范围愈加广泛，近年来很多国内外学者对NAFLD的诊断及其发病机制进行了大量研究，但目前尚缺乏有效治疗方案。目前在NAFLD的治疗中多使用熊去氧胆酸、吡格列酮、二甲双胍、ω3脂肪酸、他汀类等药物，但是长期使用会产生不良反应[2～5]。因此，寻求对NAFLD治疗有效且无不良反应的药物已经成为研究的热点。石斛为传统中药，可益胃生津、滋阴清热，是中医治疗消渴证的传统要药。近年来，大量国内外研究[6～8]表明,石斛有增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化、保肝、降血脂等作用。2018年6月2日～2019年12月7日，本研究观察了石斛灌胃对NAFLD小鼠肝细胞内脂肪过度沉积的改善作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 小鼠、试剂与仪器 雄性SPF级C57BL/6J小鼠40只，体质量22～25 g，4周龄，购自广东省医学实验动物中心。电泳仪购自美国Bio-Rad公司，显影仪购自美国Bio-Rad公司，全波长酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司，PCR仪购自美国Thermo赛默飞世尔科技公司，蛋白酶抑制剂购自瑞士Roche公司，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自碧云天生物技术公司，p-mTOR兔单克隆抗体、p-p70兔单克隆抗体、GAPDH兔单克隆抗体购自美国CST公司，DMEM培养基购自加拿大海克隆公司，甘油三酯(TG)试剂盒、总胆固醇(TC)试剂盒购自中生北控生物技术公司，天门冬氨酸氨基转移酶(AST/GOT)试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(ALT/GOT)试剂盒购自南京建成生物技术公司，引物购自生工生物科技有限公司，SYBR®Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司。

1.2 NAFLD模型制备、分组及石斛给予方法 取10只C57BL/6J雄性小鼠作为正常对照组，普通饲料喂养，剩余30只小鼠用高糖高脂饲料连续饲养12周，建立NAFLD模型。将30只NAFLD模型小鼠随机分成模型组、石斛低剂量组、石斛高剂量组，每组10只。石斛低剂量组、石斛高剂量组分别给予200 mg/(kg·d)、400 mg/(kg·d)石斛汤剂灌胃，模型组、正常组均灌服等体积生理盐水，连续灌胃14周。

1.3 各组小鼠总体状态观察 灌胃结束后，观察各组小鼠体形、体质量、腹围、皮毛光泽度及活动量等总体状态。

1.4 各组小鼠血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)检测 灌胃结束后，各组小鼠禁食12 h，乙醚麻醉，眼下静脉丛取血，室温下静置30 min使血液自然凝固，3 000 r/min离心15 min，分离出血清，采用生化测试试剂盒检测血清TG、TC、AST、ALT。

1.5 各组小鼠肝脏组织病理观察 灌胃结束后，水合氯醛麻醉后处死小鼠，取出肝脏，切取部分组织用10%甲醛固定48 h，脱水、包埋、切片、脱蜡后，用伊红-苏木素染液染色，透明封固，最后中性树胶封片，于倒置相差显微镜下观察。

1.6 各组小鼠肝脏组织中固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1c)mRNA、脂肪酸合成酶(FAS) mRNA检测 采用PT-PCR法。取100 mg小鼠肝脏组织，加入1 mL TRIzol匀浆，加入0.2 mL CHCl3使蛋白变性并抑制RNase活性，混匀后4 ℃ 12 000 r/m离心10 min，吸取水相层液体与异丙醇等体积混合均匀，室温静置10 min，4℃ 12 000 r/m离心10 min，吸弃上清溶液，75%的乙醇洗涤沉淀2次，用DEPC水溶解RNA沉淀，测定RNA纯度及浓度，将溶解后的RNA按试剂盒说明书进行逆转录及PCR扩增。扩增条件为95℃ 2 min，95℃、5s，60℃、32s，共40个循环。引物序列如下：SREBP-1c正向引物为5′-GACAGCCCAGTCTTTGAGGA-3′，反向引物为5′-CAGGACAGGCAGAGGAAGAC-3′；FAS正向引物为5′-TTCCGAGATTCCATCCTACG-3′，反向引物为5′-AGGCTCACAAACGAATGGAC-3′；GAPDH正向引物为5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，反向引物为5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。以2-ΔΔCt法表示组织中目的mRNA的相对表达量。

1.7 各组小鼠肝脏组织中p-mTOR蛋白检测 采用Western Blotting法。取100 mg小鼠肝脏组织，加入500 μL的RIPA裂解液，匀浆混匀，4 ℃条件下12 000 r/m离心10 min，吸取上清液，BCA法定量后，将蛋白与上样缓冲液混匀，100 ℃变性，通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白、转膜，用5%BSA封闭1 h，分别加入p-mTOR一抗、GAPDH 4 ℃过夜，次日洗膜后二抗孵育2 h，TBST洗膜后进行显影，并分析蛋白灰度值，以目标蛋白灰度值/内参蛋白灰度值)表示目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组小鼠总体状态 模型组小鼠体形明显大于正常组，体质量和腹围也较正常组明显增加，动作自如，但皮毛粗糙失去光泽且易脱毛。石斛低剂量组、石斛高剂量组小鼠活动量正常，活动灵敏，精神正常，皮毛光泽。

2.2 各组小鼠血清TG、TC、AST、ALT比较 正常组小鼠血清TG、TC、AST、ALT分别为(0.72±0.15)、(0.83±0.18)、(2.51+0.19)、(1.89±1.78)mmol/L，模型组小鼠血清TG、TC、AST、ALT分别为(1.30±0.12)、(1.48±0.17)、(5.86+10.46)、(4.55±0.26)mmol/L，两组相比，P<0.05。

模型组、石斛低剂量组、石斛高剂量组小鼠血清TG、TC、AST、ALT水平比较见表1。由表1可知，石斛低剂量组、石斛高剂量组小鼠血清TG、TC、AST、ALT水平均低于模型组(P均<0.05)，石斛高剂量组小鼠血清ALT水平低于石斛低剂量组(P<0.05)。

表1 模型组、石斛低剂量组、石斛高剂量组小鼠血清TG、TC、AST、ALT水平比较

2.3 各组小鼠肝脏组织病理变化 正常组小鼠的肝细胞排列有规则，肝小叶结构清晰，界板分明平滑，其内皮细胞、贮脂细胞未见明显的增生；肝窦结构清晰；肝脏中的肝细胞核居中，汇管区结构清晰，纤维结缔组织无明显增生，胆管完整。模型组小鼠肝细胞肿大，脂滴较多，并有脂肪囊肿形成。石斛低、高剂量组小鼠肝脏中脂肪肝转态减轻。见图1。

图1 各组小鼠肝脏组织病理变化

2.4 各组小鼠肝脏组织中SREBP1c mRNA、FAS mRNA相对表达量比较 正常组小鼠肝脏组织中SREBP1c mRNA、FAS mRNA相对表达量分别为1.05±0.01、1.03±0.04，模型组小鼠肝脏组织中SREBP1c mRNA、FAS mRNA相对表达量分别为7.63±0.38、5.05±0.34，两组相比，P均<0.05。

模型组、石斛低剂量组、石斛高剂量组肝脏组织中SREBP1c mRNA、FAS mRNA相对表达量比较见表2。由表2可知，石斛低剂量组、石斛高剂量组小鼠肝脏组织中SREBP1c mRNA、FAS mRNA相对表达量均低于模型组(P均<0.05)，且石斛高剂量组小鼠肝脏组织中SREBP1c mRNA、FAS mRNA相对表达量均低于石斛低剂量组(P均<0.05)。

表2 模型组、石斛低剂量组、石斛高剂量组小鼠肝脏组织中SREBP1c mRNA、FAS mRNA相对表达量比较

2.5 各组小鼠肝脏组织中p-mTOR蛋白相对表达量比较 正常组小鼠肝脏组织中p-mTOR蛋白相对表达量为0.16±0.01，模型组小鼠肝组织中p-mTOR蛋白相对表达量为0.32±0.02，两组相比，P<0.05。模型组、石斛低剂量组、石斛高剂量组肝脏组织中p-mTOR蛋白相对表达量分别为0.32±0.02、0.17±0.01、0.21±0.02，组间相比，P均<0.05。

3 讨论

NAFLD是我国第二大肝脏疾病，其发病率呈上升趋势。NAFLD主要是由于体内多余的脂质在肝脏堆积，进而引起肝脏脂肪变。早期的NAFLD病患并没有明显的机体病症，但是如果病情加重，其病症走势会转化为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等疾病[9]。

石斛是传统中医治疗消渴症的主要中药材，可养阴、生津、止渴、清肺胃虚热。研究[10]发现，石斛具有调节机体糖脂平衡的作用。有研究[11]发现，铁皮石斛水提物可降低高脂血症小鼠中LDL-C、TC水平，并提升高HDL-C水平；金钗石斛总生物碱可以通过上调Acox1、PPARα以及ATGL的表达，进而抑制降低SREBP1表达，从而起到降血脂的作用[12]。

本研究中使用高糖高脂饲料造模，诱导小鼠生成NAFLD，引起小鼠肝脏TG、TC合成增加，成模后的小鼠鼠毛油湿粗糙、体型肥大、行动较迟钝。通过石斛给药后，石斛低、高剂量组小鼠情况较模型组小鼠有所改善，说明石斛可以改善NAFLD小鼠的状态，提高其精神状态。NAFLD小鼠大量摄取脂肪，致使能量的过剩，TG、TC升高。而石斛能降低NAFLD小鼠血液中TG、TC含量，表明了石斛对NAFLD小鼠具有调节血脂的作用，降低其血脂代谢紊乱，改善血脂代谢的不良状况。高糖高脂饲料会导致小鼠血脂紊乱，进而增加了肝脏的代谢负担，同时会对机体的心血管系统造成损害。本研究中发现，模型组小鼠血液中AST、ALT水平显著上升，说明长期摄入高脂饲料后，模型组小鼠的肝脏可能受到损伤，肝功能异常。而石斛能显著下降NAFLD小鼠血液AST、ALT水平，说明石斛对肝脏有保护作用。SREBPs是碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链家族的转录因子，当检测到机体体内的细胞胆固醇水平异常升高时，SCAP会感测到多余的胆固醇，SREBPs丧失其S1P和S2P应答，进而迅速改变其bHLH构象，使ER膜停止ER运输小泡。SREBPs包括SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2。其中，SREBP-2是由人染色体22q13的基因编码，SREBP-1a和-1c主要是由外显子1指定1a和1c的，其替代转录起始位点是来源于人染色体17p11.2的单个基因。其中，SREBP-1a主要介导胆固醇、脂肪酸和甘油三酯的合成，是SREBP的应答基因[13]；而SREBP-1c主要功能是控制脂肪酸合成，主要分布在肝脏及大多数完整的组织中。研究[14]显示，SREBP-lc可以调节多种与脂肪合成和葡萄糖代谢有关的基因，譬如Sl4、葡萄糖激酶(GK)、低密度脂蛋白(LDL)受体、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)等。脂肪酸合成酶(FAS)是由一条相对分子质量为250 kDa的多肽链首尾相连形成的以二聚体为主要存在形式的多功能酶，存在于细胞浆中。FAS是一种合成脂肪酸的关键酶，它能影响生物的能量代谢，还能催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成脂肪酸,从而导致动物体内发生体脂沉积作用。另外，FAS也是一种限速酶，在脂肪酸再生过程中起重要作用。有研究[15]用小鼠的肝脏进行免疫组织化学观察，发现FAS在小鼠肝脏中大量表达，特别是在肝细胞的细胞质中。另外，还有研究[16]如果FAS过表达，就会导致了生物体内脂肪的沉积，进而导致肥胖。本研究结果显示，石斛能显著下降NAFLD小鼠肝脏中SREBP1c、FAS的mRNA相对表达量，与相关研究结果一致。

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，mTOR信号通路具有促进物质代谢、参与细胞凋亡、自噬的作用。mTOR含有mTORC1和mTORC2两种复合体。有研究[17]表明，mTORC1 能调节SREBP信号通路的表达，主要是通过控制磷脂酸磷酸酶Lipinl的入核来进行调控的。首先，mTORC1复合体去磷酸化后，激活lipinl前体并促进其在核内重塑，然后调节mTORC1对SREBP靶基因和核SREBP蛋白的影响[18]。在肥胖/胰岛素抗性模型中，有研究[19，20]发现，mTORC1/SREBP通路介导脂质的合成，主要是通过mTORC1引发内质网应激，促进胰岛素抵抗和SREBP-1c的裂解和激活，其机制是由于mTORC1过度激活将下调胰岛素通过IRS的降解信令，同时促进糖异生程序的进行，并正向调节SREBP-1c蛋白，诱导体内脂肪生成。本研究结果显示，石斛能显著下降NAFLD小鼠肝脏组织中p-mTOR蛋白相对表达量，与相关研究结果一致。

综上所述，石斛灌胃可改善NAFLD小鼠的肝细胞内脂肪过度沉积，其作用机制可能是与mTOR信号通路有关。