转染Survivin shRNA的皮肤鳞状细胞癌细胞系凋亡、增殖及NF-κB信号通路相关蛋白表达观察

谭亚琦，徐文俊，何焱玲

1 首都医科大学附属北京朝阳医院，北京100020；2 北京电力医院

皮肤鳞状细胞癌(cSCC)是非黑色素瘤皮肤癌第二常见的皮肤癌，占全世界所有皮肤癌的20%以上[1]。近年来，由于人口老龄化和紫外线暴露增加，cSCC的发病率在不断的增加[2]。虽然cSCC的治疗手段在不断的提高，但是仍然达不到理想的疗效，并且许多药物有严重的不良反应，从而限制了持续的临床反应，导致cSCC患者的预后较差，需要研究新的治疗方法和策略[3]。Survivin是凋亡蛋白家族(IAP)重要成员之一，也是重要的促肿瘤基因。研究[4，5]报道，在卵巢癌和胰腺导管腺癌等恶性肿瘤组织中Survivin表达上调，可促进肿瘤的恶性进展。Survivin编码的蛋白质参与多种细胞信号途径的调控，因此Survivin在细胞分裂和细胞凋亡等生理过程和肿瘤细胞侵袭、转移等病理过程中均发挥重要作用，可作为抗肿瘤治疗的靶点[6]。研究[7]显示，Survivin在cSCC干细胞样细胞中高表达，沉默Survivin可降低角质形成细胞的恶性生物学行为，提示Survivin可能在cSCC发生发展中发挥重要作用。2018年2月～2019年12月，本研究观察了转染Survivin shRNA的cSCC细胞系凋亡、增殖及NF-κB信号通路相关蛋白的表达变化，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、转染物及试剂 cSCC细胞系A431、Colo-16、SCL-1购自美国ATCC细胞库，永生化正常皮肤角质细胞HaCat购自中国上海细胞库。Survivin shRNA(通过小干扰RNA技术抑制Survivin基因表达的小分子化合物)、NC shRNA(NC对照小干扰RNA)购自中国上海吉凯公司。基础培养基、FBS和胰酶购自美国Gibco公司，TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，Bestar 1st Strand cDNA合成试剂盒购自上海DBI Bioscience公司，Survivin、内参GAPDH引物购自中国上海生工有限公司，SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR试剂购自日本TaKaRa公司，细胞凋亡检测试剂盒和蛋白上样缓冲液购自中国上海碧云天生物技术有限公司，MTS试剂购自美国Biovision公司，蛋白裂解液购自中国北京索莱宝公司，PVDF膜购自美国Millipore公司，NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、磷酸化IκB激酶α/β(p-IKKα/β)、磷酸化p65(p-p65)一抗体和兔二抗购自美国Proteintech公司，BCA试剂盒和ECL化学发光试剂盒购自美国Thermo公司。

1.2 cSCC细胞系A431、Colo-16、SCL-1和永生化正常皮肤角质细胞HaCat中Survivin mRNA检测及细胞选择 取cSCC细胞系A431、Colo-16、SCL-1和永生化正常皮肤角质细胞HaCat在含10%FBS培养基的37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞融合度达95%时，按照1∶3进行传代，采用qRT-PCR法检测细胞中的Survivin mRNA：采用TRIzol裂解法提取细胞中总RNA，采用Bestar 1st Strand cDNA合成试剂盒逆转录成cDNA，以cDNA作为模板，以GAPDH基因为内参，SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR试剂盒进行PCR反应。PCR反应条件为95 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，进行40个循环。Survivin正向引物为5′-CCGACGTTGCCCCCTGC-3′,反向引物为5′-TCGATGGCACGGCGCAC-3′；GAPDH正向引物为5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,反向引物为5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。以2-ΔΔCt表示细胞中Survivin的相对表达量。结果显示， A431、Colo-16、SCL-1、HaCat细胞中Survivin mRNA的相对表达量分别为9.18±0.62、3.72±0.50、7.41±0.60、1.00±0.00，其中A431、Colo-16、SCL-1细胞中Survivin mRNA的相对表达量高于HaCat细胞(P均<0.05)，且A431细胞中Survivin mRNA的相对表达量最高。选取Survivin mRNA的相对表达量最高的A431细胞用于后续实验。

1.3 A431细胞分组及转染 将A431细胞分为sh-Survivin组和sh-NC组。取两组细胞，胰酶消化后以1×105个细胞铺至6孔板中，待细胞贴壁后，sh-Survivin组细胞采用脂质体2000转染Survivin shRNA，sh-NC组细胞采用脂质体2000转染NC shRNA，两组细胞转染后放至培养箱中培养48 h后，采用qRT-PCR法检测各组细胞中Survivin mRNA。结果显示，sh-Survivin组、sh-NC组细胞中Survivin mRNA的相对表达量分别为0.32±0.04、1.00±0.01，两组相比，P<0.05，提示Survivin shRNA成功转染A431细胞，并抑制Survivin mRNA的表达。

1.4 两组细胞凋亡率测算 采用细胞周期实验。取两组细胞，常规转染48 h后，PBS洗3次，加入4 ℃的无水乙醇固定细胞2 h，PBS洗2次，按照细胞凋亡试剂盒说明书加入染色缓冲液500 μL、Annexin V-FITC和PI各5 μL，常温避光孵育15 min，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.5 两组细胞增殖能力观察 采用MTS法。取两组细胞以每孔1 500个接种于96孔板中，转染后放至细胞培养箱中培养，在第1、2、3、4 d时，分别加入20 μL的MTS试剂，放置培养箱中避光2 h后，使用全波长扫描仪检测各孔在波长490 nm处的OD值，以OD值表示细胞增殖能力。

1.6 两组细胞IκBα、p-IKKα/β、p-p65蛋白检测 采用Western Blotting法。取两组细胞，转染48 h后收集细胞，PBS洗3次，加入蛋白裂解液，14 000 r/min离心30 min，取离心后的上清液，BCA试剂盒测得蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液于沸水中煮沸变性，SDS-PAGE凝胶电泳80 V分离蛋白2 h，350 mA电湿转至PVDF膜2 h，5%BSA室温孵育PVDF膜1 h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，以GAPDH为内参，ECL化学发光液、显影液和定影液曝光蛋白条带，采用Image J软件检测蛋白灰度值。目的蛋白相对表达量为目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

2 结果

2.1 两组细胞凋亡率比较 sh-Survivin组、sh-NC组细胞凋亡率分别为19.21%±2.54%、4.52%±0.31%，两组相比，P<0.05。

2.2 两组细胞增殖能力比较 sh-Survivin组细胞第1、2、3、4 d时的OD值分别为0.27±0.01、0.32±0.04、0.37±0.03、0.54±0.08，sh-NC组分别为0.27±0.02、0.38±0.03、0.67±0.05和0.88±0.07，其中sh-Survivin组细胞第3、4 d时的OD值显著低于sh-NC组(P均<0.05)。

2.3 两组细胞IκBα、p-IKKα/β、p-p65蛋白相对表达量比较 sh-Survivin组中IκBα、p-IKKα/β、p-p65蛋白的相对表达量分别为0.61±0.11、0.13±0.06、0.09±0.05，sh-NC组分别为0.11±0.04、0.76±0.15、0.81±0.19，两组相比，P均<0.05。

3 讨论

cSCC是一种常见的恶性皮肤癌，起源于表皮上层中分化的角质形成细胞，对患者的生命和生存质量有很大的影响。尽管大多数早期cSCC患者可以通过手术切除成功治疗，但由于cSCC具有高侵袭性和转移性，尤其是淋巴结转移性高，cSCC显示出无法控制的生长，手术切除受到限制，只能选择化学治疗和放射治疗。研究[8]显示，cSCC对放射治疗敏感，放疗已经应用于完全淋巴结切除术后或不完全切除术后的辅助治疗，但是伴随淋巴结转移的患者对放射治疗不敏感。此外，cSCC具有高复发率，复发和转移是cSCC患者死亡与复发的主要原因[9]。紫外线、化学致癌物、病毒感染和免疫抑制剂等是cSCC患者发病的高危因素，尤其是紫外线辐射，它通过产生活性氧损害皮肤[10]。但是cSCC的发病机制仍未阐明，基因的改变已经证实与肿瘤的发生发展密切相关[11，12]，因此在分子水平探索与cSCC发病机制相关的基因是寻找新治疗靶点的重要途径。

Roberta等[7]研究报道，Survivin是角质形成干细胞的重要标记物，并维持肿瘤的发展、侵袭和复发，Survivin表达减少可抑制cSCC角质形成细胞的克隆和生长能力，并认为Survivin是cSCC发育的关键基因。Survivin在其它恶性肿瘤中报道为促癌基因。在卵巢癌和胰腺导管腺癌中，Survivin抑制细胞凋亡，并促进细胞生长[4，5]。研究[13]显示，Survivin是重要的抗凋亡分子，其通过IAP重复结构域与胱天蛋白酶结合而对其活化具有抑制作用，发挥抗细胞凋亡和保护细胞生长的作用。此外，Survivin是染色体乘客复合物的组成部分，参与调节细胞生长重要过程-有丝分裂纺锤体的形成，即在有丝分裂过程中准确调节染色体的分离，促进细胞的生长[14]。因此，本研究观察了Survivin对cSCC细胞凋亡和生长作用的影响。

本研究首先采用qRT-PCR法检测Survivin在cSCC细胞系中的表达情况，结果显示，与永生化正常皮肤角质细胞HaCat相比，Survivin在cSCC细胞系A431、Colo-16和SCL-1中的表达显著增加，并选择Survivin表达最高的cSCC细胞系A431进行Survivin shRNA的转染，qRT-PCR验证A431细胞中Survivin表达减少后，细胞周期实验和MTS实验发现Survivin shRNA促进A431细胞的凋亡和抑制A431细胞的生长能力，但其作用的分子机制仍需进一步探索。

Survivin是多种细胞信号的重要节点[5]，通过靶向Survivin，可能同时阻制了多种肿瘤信号通路。Sim等[15]报道，Survivin的一种小分子抑制剂YM155可以抑制肾透明细胞癌中NF-κB信号通路，即减少p65磷酸化表达水平，并减弱了p65/p50异二聚体的转录能力。NF-κB信号通路介导肿瘤的凋亡和生长能力[16]，在cSCC中处于异常激活状态[17]，p65和p50以异型二聚体的形式构成NF-κB，在细胞质中NF-κB与IκBα结合，处于抑制状态，IκBα可被p-IKKα/β通过泛素化途径降解，使得NF-κB处于游离状态，同时p-IKKα/β可以磷酸化p65，最终导致NF-κB信号通路被激活[18]。本研究采用Western Blotting法检测发现Survivin shRNA抑制p-IKKα/β和p-p65蛋白的表达，促进IκBα蛋白的表达，表明Survivin shRNA可能通过抑制NF-κB信号通路促进cSCC细胞的凋亡和降低细胞的生长能力。

综上所述，干扰Survivin可促进cSCC细胞凋亡、抑制cSCC细胞增殖，其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路的激活有关。Survivin可能是cSCC患者治疗的潜在靶点。