氢化物-原子吸收光谱法测定人凝血酶原复合物中锑的含量

2020-08-11吴勰乾霍建富连建科

山西医科大学学报 2020年7期

吴勰乾,韩杨,霍建富,连建科,任飞

(1 山西康宝生物制品股份有限公司技术中心,长治 046000;2 长治医学院中心实验室;*通讯作者,E-mail:renfei@czmc.edu.cn)

人凝血酶原复合物(human prothrombin complex)系由健康人血浆经低温乙醇蛋白分离法或经批准的其他分离法分离纯化,并经病毒去除和灭活处理、冻干制成[1]。临床上广泛应用于治疗乙型血友病、FⅡ、FⅦ及FⅩ先天性缺乏、产生FⅧ抑制物的甲型血友病和因肝疾患引起的凝血功能异常以及由维生素K缺乏而继发的Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子低下所致的出血症[2,3]。

人凝血酶原复合物使用的药包材为中性硼硅玻璃模制注射剂瓶和注射用冷冻干燥用卤化丁基橡胶塞,注射剂瓶中常加入三氧化二锑作为澄清剂[4],对人体具有慢性毒性与致癌性[5]。为保证药品质量,我们针对人凝血酶原复合物进行了锑含量的研究。

根据《药用玻璃铅、镉、砷、锑浸出量限度》[6]和《砷、锑、铅、镉浸出量测定法》[7]可知YBB标准中锑含量的常用测定方法为孔雀石绿-分光光度法,但该法测定前处理操作繁琐,所用试剂如甲苯、孔雀绿均对人体毒性较大,方法灵敏度低。因此我们购置了锑阴极灯,并参考文献[4]和《中国药典》2015年版四部通则2321“铅、镉、砷、汞、铜测定法”[8]中砷含量的测定方法,建立了更简单、快速、灵敏度高、对人体毒性小的氢化物-原子吸收光谱法测定人凝血酶原复合物中锑含量的测定方法,进行了方法学研究。

1 试剂与仪器

1.1 试剂

人凝血酶原复合物(山西康宝生物制品股份有限公司,批号:20170905-1、20170905-2、20170905-3);锑单元素溶液标准物质(以下简称锑标准溶液,含量:100 μg/ml,中国计量科学研究院,批号:GBW(E)080545-16094);硝酸(优级纯,上海阿拉丁公司,批号:H160105);硼氢化钠(分析纯,山东西亚化学股份有限公司,批号:Q9812);氢氧化钠(分析纯,天津市富起化工有限公司,批号:160418);浓盐酸(药用级,成都华邑药用辅料制造有限公司,批号:20170404);碘化钾(分析纯,国药集团化学试剂有限公司,批号:20121128);抗坏血酸(分析纯,上海阿拉丁公司,批号:1325051);注射用水(山西康宝生物制品股份有限公司)。

1.2 仪器

AA-6300C型原子吸收分光光度计(日本岛津公司);WHG-630A型流动注射氢化物发生器(北京浩天晖科贸有限公司);锑空心阴极灯(日本岛津公司);MD20H型微波消解仪(奥普乐仪器有限公司);加热板(北京中兴伟业仪器有限公司);HH-4型水浴锅(常州市金坛科兴仪器厂)。

实验中所有使用到的玻璃器皿均需浸泡在10% HNO3溶液中24 h以上,使用前先用自来水冲洗干净,再用注射用水冲洗干净。

2 方法与结果

2.1 测定条件

采用流动注射氢化物发生器,以含1%硼氢化钠和0.3%氢氧化钠溶液(临用前配制)作为还原剂,盐酸溶液(1→100)为载液,氮气为载气,检测波长为217.6 nm,光源灯电流13 mA,狭缝0.7 nm。

2.2 试液配制

2.2.1 锑标准贮备液的制备精密量取锑标准溶液适量,用2%硝酸溶液稀释,制成每1 ml含锑100 ng的溶液。

2.2.2 2%硝酸溶液量取硝酸适量,用水稀释制成2%的溶液。

2.2.3 含1%硼氢化钠和0.3%氢氧化钠溶液称取氢氧化钠0.3 g,硼氢化钠1.0 g,用水溶解后,加水至100 ml,摇匀(临用前配制)。

2.2.4 盐酸溶液(1→100) 量取浓盐酸1 ml,用水稀释至100 ml。

2.2.5 25%碘化钾溶液称取碘化钾25 g,用水溶解后,加水至100 ml,摇匀(临用前配制)。

2.2.6 10%抗坏血酸溶液称取抗坏血酸10 g,用水溶解后,加水至100 ml,摇匀(临用前配制)。

2.2.7 盐酸溶液(20→100) 量取浓盐酸20 ml,用水稀释至100 ml。

2.3 测定方法

标准曲线的标定:每次测定前需先进行标准曲线的标定,操作方法详见2.4.1。

供试品溶液的制备:取供试品,加10 ml注射用水,轻轻摇动至完全溶解。精密量取5 ml置消解罐内,加浓硝酸5 ml,在设定好的消解程序(第一步5 min升温至120 ℃保持3 min,第二步5 min由120 ℃升温至150 ℃保持3 min,第三步由150 ℃升温至180 ℃保持15 min)中进行微波消解。消解完全后置电热板上缓缓加热至红棕色蒸汽挥尽,放冷,转入10 ml量瓶中,用少量2%硝酸洗涤消解罐,洗液一并入量瓶中,用2%硝酸定容至刻度,摇匀。精密量取10 ml,置25 ml量瓶中,加25%碘化钾溶液(临用前配制)1 ml,摇匀,加10%抗坏血酸溶液(临用前配制)1 ml,摇匀,用盐酸溶液(20→100)稀释至刻度,摇匀,密塞,置80 ℃水浴中加热3 min,取出,放冷,作为供试品溶液,同法同时制备供试品空白溶液。

测定法:取适量,吸入流动注射氢化物发生器,测定吸光度。将供试品吸光度代入标准曲线方程计算供试品溶液中锑的含量。

2.4 方法学研究

2.4.1 线性关系与范围的考察分别精密量取锑标准贮备液适量,用2%硝酸溶液稀释制成每1 ml分别含锑0,5.0,10.0,15.0,20.0,25.0 ng的溶液,再精密吸取10 ml,置25 ml量瓶中,加25%碘化钾溶液(临用前配制)1 ml,摇匀,加10%抗坏血酸溶液(临用前配制)1 ml,摇匀,用盐酸溶液(20→100)稀释至刻度,摇匀,密塞,置80 ℃水浴中加热3 min,取出,放冷,同法同时制备对照品空白溶液。取适量,吸入流动注射氢化物发生器,测定吸光度。以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,回归计算。回归方程:y=0.008 3x+0.008 5,r=0.997 1。式中:y为吸光度值;x为锑浓度,单位为ng/ml。锑浓度对吸光度的线性关系结果见表1。结果表明:锑含量在0-25.0 ng/ml范围内线性关系良好。

表1 线性关系试验结果Table 1 Results of the linear relationship

2.4.2 检出限和定量限的测定取试剂空白溶液(2%硝酸溶液)连续测量11次,记录吸光度值,求出标准差,结果见表2。

表2 试剂空白溶液吸光度值 (n=11)Table 2 Absorbance of the blank solution (n=11)

按2.4.1方法,以每1 ml分别含锑0,5.0,10.0,15.0,20.0,25.0 ng的对照溶液,测定吸光度,做线性回归方程,得标准曲线斜率。检出限=3×空白标准差/标准曲线斜率;定量限=10×空白标准差/标准曲线斜率。结果检出限为0.553 3 ng/ml;定量限为1.844 ng/ml。

2.4.3 标准溶液重复测定的精密度试验取锑标准溶液(10.0 ng/ml),连续进样6次,记录吸光度值,计算平均吸光度和RSD值,结果见表3。结果显示:RSD值为4.36%,说明该方法精密度良好。

2.4.4 加样回收率试验取人凝血酶原复合物(批号:20170905-1),加10 ml注射用水,轻轻摇动至完全溶解。精密量取5 ml置消解罐内,加浓硝酸5 ml,在设定好的消解程序(第一步5 min升温至120 ℃保持3 min,第二步5 min由120 ℃升温至150 ℃保持3 min,第三步由150 ℃升温至180 ℃保持15 min)中进行微波消解。消解完全后置电热板上缓缓加热至红棕色蒸汽挥尽,放冷,转入10 ml量瓶中,用少量2%硝酸洗涤消解罐,洗液一并入量瓶中,用2%硝酸定容,摇匀。

回收率样品溶液制备:精密量取供试品消解后溶液5 ml,置25 ml量瓶中,共9份样品,分别加入锑标准贮备液(100 ng/ml)1.0,1.5,2.0 ml,再各加入2%硝酸溶液4.0,3.5,3.0 ml,制成低、中、高浓度的回收率样品溶液各3份。各样品再加25%碘化钾溶液(临用前配制)1 ml,摇匀,加10%抗坏血酸溶液(临用前配制)1 ml,摇匀,用盐酸溶液(20→100)稀释至刻度,摇匀,密塞,置80 ℃水浴中加热3 min,取出,放冷,作为回收率样品溶液。取适量,吸入流动注射氢化物发生器,测定吸光度。将回收率样品溶液吸光度代入标准曲线方程计算出锑的含量,计算回收率,结果见表4。