距离-温度联合的新型筛选法提高人精子质量的效果分析

饶金鹏，邱 枫，蔡益婷，魏 凯，金 敏，金 帆

(浙江大学医学院 1.附属第二医院 生殖医学中心； 2.附属妇产科医院 生殖遗传教育部重点实验室， 浙江 杭州 310000)

筛选获得高质量精子是辅助生殖(assist reproductive technology, ART)体外受精成功的关键之一，密度梯度离心(density gradient centrifugation, DGC)或上游(swim-up, SU)因操作简单，并能在较短时间内将活力较好的精子从精浆、死精、白细胞、病原微生物等有害物质中分离出来，而成为广大生殖医学中心采用的主流方法。已有研究显示DGC及SU处理后的运动精子在DNA完整性、细胞膜成熟度或细胞超微结构上存在一定比例的缺陷[1]，这可能影响ART的受精率，增加缺陷精子与卵子结合的风险。

人体内受精是一个自然选择的过程。精子需从阴道开始，经过长距离的游动，先后经过宫颈、子宫和输卵管，而当精子游至输卵管时，由于管腔内温度梯度的存在，使得具有热趋向性的获能精子定向游到壶腹部与卵子结合[2-3]。但目前绝大多数生殖医学中心在使用DGC或SU处理完精液后，未对精子进行进一步的长距离筛选，而将温度趋向性机制引入ART的报道也仅见于哺乳动物[4-5]。本研究通过增加获能精子的水平游动距离，并设置温度梯度，分析不同距离、温度条件下精子活力、浓度、正常形态率及DNA碎片率等指标的变化，探讨适宜的距离-温度条件组合(distance-temperature-combined selection conditions)，为进一步改善ART中优质授精精子的制备提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试剂：40%和80%梯度离心培养液(SAGE公司)；精子洗涤液Sperm Rinse、配子处理液G-GAMETE、石蜡培养油(Vitrolife公司)；人血清白蛋白(Irvine公司)；Diff-Quik精子快速染色试剂盒、精子DNA碎片检测试剂盒(深圳博锐德生物科技有限公司)；甲醇、乙醇(杭州双林化工试剂有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 精液样本：选取2019年1月至2019年9月于浙江大学医学院附属第二医院男科行精液常规检查正常的精液样本20份(均保证取精前禁欲2～7 d)。保留部分精液原液(O组)后，将余下精液小心加到含有80%和40%密度梯度离心液的管中，300×g离心15 min，收集底部沉淀并重悬于5 mL精子洗涤液中200×g离心10 min，再用5 mL精子洗液重复洗涤一遍后将精子沉淀重悬于0.5 mL的体外配子处理液G-GAMETE中，即得到去除了精浆、白细胞等杂质的获能精子。样本取材经浙江大学医学院附属第二医院伦理委员会审批通过(伦理审批编号：研2019-209)，患者知情并同意将样本用于科学研究。

1.2.2 距离-温度联合筛选精子：选取直径为100 mm的培养皿，用记号笔在圆皿外底面标记不同长度(2、5和8 cm)的刻度线，再用加样器吸取恒定液体量(500 μL)的G-GAMETE培养液并沿背面刻度线加注并拉出宽度相同的条状液滴，最后在液滴表面覆盖石蜡油。将恒温培养箱温度分别设置为32 ℃和37 ℃，将装有条状液滴的培养皿分别放入不同温度的培养箱内。其中，32 ℃培养箱中部分培养皿底部一侧垫有37 ℃恒温电热片，保证皿内3条液滴的右侧对齐并位于电热片导热区的正上方，同时使用微滴温度检测仪对培养皿中条状液滴的不同区段进行温度测定，以验证形成32 ℃～37 ℃的温度梯度(图1)。培养液均需在箱中平衡4 h以上，从而形成A1(2 cm,32 ℃)、A2(5 cm,32 ℃)、A3(8 cm,32 ℃)、B1(2 cm,37 ℃)、B2(5 cm,37 ℃)、B3(8 cm,37 ℃)、C1(2 cm,32 ℃～37 ℃)、C2(5 cm,32 ℃～37 ℃)、C3(8 cm,32 ℃～37 ℃)9组不同的距离-温度联合筛选条件。将离心后的获能精子分成体积相等(50 μL)的10份,留存1份作为初始样本I组(0 cm,37 ℃)，其余9份添加到各条状液滴的一端，孵育60 min后，从液滴的另一端收集精子样本进行后续实验。

The right side of three strip droplets are aligned and placed on the heating plate forming a temperature gradient图1 距离-温度联合筛选法Fig 1 Distance-temperature-combined spermselection approach

1.2.3 精子浓度、活力的测定：充分混匀精液标本，取标准体积的精液置于改良Neubauer血细胞计数板上，盖上盖玻片，当相差显微镜视野中精液不再漂浮，计数并计算精子浓度[6]。对样本进行计算机辅助精子分析(computer-aided sperm analysis，CASA)，通过前向运动(progressive motility, PR)、非前向运动(non-progressive motility, NP)及不动(immobility, IM)精子数据的读取，评估精子的活力[6]。

1.2.4 精子形态学评价：采用Diff-Quik快速染色法评估精子选择对形态学的影响。将10 μL精子样本均匀涂布于洁净的载玻片上，空气中自然干燥后，使用固定剂(三芳基甲烷)、染液A(嗜酸性氧杂蒽)、染液B(嗜碱性硫氮杂苯)对玻片染色，流水浸洗除去多余染剂，干燥后于100×油镜下观察染色精子，判断并计数正常形态精子所占的比例[6]。

1.2.5 精子DNA损伤检测：采用精子染色质扩散试验(sperm chromatin dispersion assay, SCD)来判断精子优选的效果[6-7]。使用深圳博锐德精子DNA碎片检测试剂盒，取定量精子样本加入到预先

装于Eppendorf管中的呈融化状态的琼脂糖凝胶中，混合后取30 μL制作涂片，并于4 ℃冰箱中静置5 min， 使精子包埋于琼脂糖微凝胶，将涂片浸入酸性反应液A(7 min)和反应液B(25 min)，再经过蒸馏水和乙醇洗脱，使精子发生酸变性并去除核蛋白，最后再经过瑞氏染色后于200×镜下观察精子双链DNA扩散形成特征性光晕的情况，光晕宽度≤精子头部最小直径的1/3视为碎片化精子，最后计算DNA损伤精子百分比。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 精子浓度的比较

在温度条件相同情况下孵育60 min，精子的浓度随着水平游动距离的延长呈极显著下降(P<0.01)。在距离相同的条件下，32 ℃～37 ℃温度梯度中精子的浓度显著性高于恒温32 ℃或恒温37 ℃中精子的浓度(P<0.01)，恒温32 ℃与恒温37 ℃中精子浓度无明显差异(表1)。

表1 不同距离-温度联合筛选条件下精子浓度的比较Table 1 Comparison of sperm concentration by different distance-temperature-combined selection n=20)

2.2 精子活力的比较

在进行距离-温度联合筛选之前，使用密度梯度离心法处理后得到的获能精子，其活动精子百分率(PR+NP)显著性高于精液原液的活动精子百分率(P<0.01)。32 ℃、37 ℃、32 ℃～37 ℃条件下，随着距离的延长，精子活力无明显提高(图2)。

O.original sperm sample before DGC; I.initial capacitated sperm after DGC; A1～C3.sperm samples processed by different distance-temperature selection conditions; *P<0.01 compared with group O图2 不同距离-温度联合筛选条件下精子活力的比较Fig 2 Comparison of sperm motility by differentdistance- temperature-combined selection

2.3 精子形态正常率的比较

精子采用Diff-Quik法进行染色并判断其形态是否正常(图3A)。在进行距离-温度联合筛选之前，使用密度梯度离心法处理后得到的获能精子，其正常形态率与精液原液的正常形态率相比无明显差异。在温度条件相同情况下，经过长距离(5、8 cm)筛选获得的精子比初始的获能精子(0 cm)具有更高的正常形态率(P<0.05)。在距离相同的条件下，32 ℃～37 ℃温度梯度中精子的正常形态率略高于恒温32 ℃或恒温37 ℃中精子的正常形态率，但差异不明显(图3B)。

A.part of sperm morphology(×1 000); 1.normal; 2～8. abnormal; B.the percentage of sperm with normal morphology after different treatments; O.original sperm sample before DGC; I.initial capacitated sperm after DGC; A1～C3.sperm samples processed by different distance-temperature selection conditions; *P<0.05 compared with group I

2.4 精子DNA碎片率的比较

经SCD法检测后含有DNA碎片的精子或DNA完整的精子(图4A)。距离-温度联合筛选前，密度梯度离心法处理后得到的获能精子，其DNA碎片率与精液原液的DNA碎片率相比无明显差异。恒温条件下，长距离(5、8 cm)筛选获得的精子，其DNA碎片率略低于短距离(2 cm)以及初始获能精子。长距离(5、8 cm)联合32 ℃～37 ℃温度梯度，其DNA碎片率较初始获能精子进一步降低(P<0.05，图4B)。

A.effect of sperm chromatin dispersion assay(×200); sperm with integrated DNA (yellow arrows) and sperm with DNA fragmentation (blue arrow); B.the percentage of sperm with DNA fragmentation after different treatments; O.original sperm sample before DGC; I.initial capacitated sperm after DGC; A1～C3.sperm samples processed by different distance-temperature selection conditions; *P<0.05 compared with group I

3 讨论

本研究基于女性生殖道距离较长以及存在温度梯度的特性，设置不同的距离、温度条件对具有更好前向运动性及温度趋向性的精子进行进一步优选。实验结果显示，经过长距离(5、8 cm)的水平游动，精子的正常形态率显著高于初始获能精子以及精液原液的正常形态率，原因可能在于较长的距离设置更接近女性生殖道的生理长度，从而筛选得到更高比例具有正常迁移能力的精子[8]。短距离(2 cm)条件对检验精子迁移能力相对有限，且随着孵育时间的延长，一部分低质量精子会借助液体的扩散作用移动到临近的收集区域， 故筛选效果不明显。上游法由于加入到精液上方的培养基体积较小[9]，使精子游动的距离同样较短，且在吸取上清的过程中存在将底部沉淀一同吸起的风险，因此其效果也不如长距离筛选。

本研究将温度梯度设为32 ℃～37 ℃，不同于以往文献报道的温度梯度设置[10-11]。原因在于本研究的目的是将筛选获得的精子用于人的体外受精，41 ℃[10]或39 ℃[11]的温度上限设置超出了人体正常的生理温度，而高温会导致精子DNA、线粒体或细胞膜的损伤[12]。前期的研究显示，只有获能的精子具有改变其原有运动方向并朝着温度更高区域游动的能力[2-3]。因此，本研究在使用温度梯度筛选精子前首先使用密度梯度离心使精子获能。实验结果显示，无论在2、5还是8 cm的条件下，32 ℃～37 ℃温度梯度中精子的浓度都显著高于恒温32 ℃或恒温37 ℃中精子的浓度，证实了人精子具有温度趋向性，这与用热分隔管获得的结果相一致。此外，在长距离(5和8 cm)条件下， 32 ℃～37 ℃的温度梯度使得所获得精子的DNA碎片率显著低于初始获能精子的DNA碎片率。这可能是由于能够沿着温度梯度游过较长距离的精子，其内部由磷脂酶C和肌醇三磷酸受体Ca2+通道介导的温度趋向性机制能正常运作[3]，而正常运作的前提是需要精子细胞具有较好的DNA完整性。

随着距离的延长或温度梯度的增设，精子的活力未见显著性提高，这应该是由于传统的密度梯度离心法在筛选获得高活力精子方面效果明显，使得活力进一步提升的空间受限。但随着距离的延长，精子的浓度呈极显著下降趋势，这与精子体内受精的情况相一致[13]。而即使增设了温度梯度条件，在有限时间内经过8 cm的水平距离游动，所获得的精子密度也是极低的(0.6×105个/mL)，难以达到正常体外受精所需精子量的下限值(1.5×105个/mL)[9,14]。而(5 cm，32 ℃～37 ℃)条件下所获得精子的活力、正常形态率、DNA碎片率与(8 cm，32 ℃～37 ℃)条件下相当，但精子密度更高(8×106个/mL)，能够达到实施体外受精精子浓度的标准。因此，认为(5 cm，32 ℃～37 ℃)条件下优选获得的精子，可能更适宜应用于今后体外受精的临床实践。较低的精子正常形态率与体外受精后较低的持续妊娠率呈显著性相关，而精子DNA碎片率过高也会导致受精失败、早期流产、新生儿缺陷等不良ART结局[15]。距离-温度联合的新型筛选法比传统精液体外处理法能够获得正常形态率更高，DNA碎片率更低的精子，可降低体外受精过程中缺陷精子与卵子发生结合的风险，相信该方法的应用能够使广大不孕症患者获益。