miR-205-5p抑制体外胃癌细胞系增殖、迁移和侵袭

杨屹立，何学元，潘新民，马建勋

(甘肃省人民医院 普外科, 甘肃 兰州 730000)

miRNA是一类长度为18～25个核苷酸的内源性非编码小RNA，其通过与靶基因mRNA的3′-UTR特异性结合，导致靶基因mRNA降解或抑制翻译过程进而下调靶基因的表达，参与对细胞增殖、分化、凋亡及肿瘤的发生和转移等生理病理过程的调控[1]。miR-205-5p定位于1号染色体q32.2位置，已证实与鼻咽癌、结肠癌和肾上腺皮质癌等多种恶性肿瘤的增殖转移有关[2-4]。目前，尚未有miR-205-5p对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭影响的相关研究。RAP2B在生物体内是一种癌基因，其在促进肿瘤细胞增殖和转移等生物学过程发挥重要作用[5]。Wnt/β-catenin信号通路与多种恶性肿瘤的发展和转移密切相关[6-7]。因此，推测miR-205-5p可能通过介导RAP2B表达调控Wnt/β-catenin信号通路，进而影响胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。本研究探讨了miR-205-5p和RAP2B对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响，旨在为miR-205-5p作为胃癌的临床治疗靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

胃癌细胞系AGS、MGC803、MKN-28、SGC-7901和正常胃黏膜细胞系GES-1(ATCC)；胎牛血清(杭州四季青公司)；青链霉素双抗(HyClone公司)，DMEM和RPMI-1640培养基(Gibco公司)；LipofectamineTM2000相关转染试剂和Trizol试剂(Invitrogen公司)；MTT试剂、DMSO试剂和Western blot相关试剂(北京索莱宝公司)；Transwell小室和Matrigel基质胶(BD公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司)；PCR引物、miR-con、miR-205-5p、si-con、si-RAP2B、pcDNA、pcDNA-RAP2B、MUT-RAP2B和WT-RAP2B的构建、测序(上海生工公司)；RAP2B、cyclin D1、MMP-2和MMP-14抗体(Abcam公司)；β-actin、GSK-3β和β-catenin抗体(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养、转染和分组：用DMEM培基培养GES-1细胞，用RPMI-1640培养基分别培养AGS、MGC803、MKN-28和SGC-7901细胞，培养基内均添加1%青链霉素双抗、10%胎牛血清。培养条件：37 ℃、5% CO2、湿度饱和。当细胞增殖至汇合度达到80%时，胰蛋白酶消化传代。细胞转染：利用LipofectamineTM2000将miR-con、miR-205-5p模拟物、si-con和si-RAP2B分别转染至汇合度约为50%的AGS，24～48 h后进行后续实验。为进一步验证miR-205-5p是通过下调RAP2B表达来调控AGS细胞的增殖、迁移和侵袭的，在AGS细胞中同时转入miR-205-5p模拟物和pcDNA-RAP2B，检测AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力变化。实验分组如下：对照组(正常培养的AGS细胞)、miR-con组(转染miR-con)、miR-205-5p组(转染miR-205-5p 模拟物)、si-con组(转染si-con)、si-RAP2B组(转染si-RAP2B)、miR-205-5p+pcDNA组(miR-205-5p和pcDNA共转染)和miR-205-5p+pcDNA-RAP2B组(miR-205-5p和pcDNA-RAP2B共转染)。

1.2.2 RT-qPCR检测miR-205-5p和RAP2B mRNA的表达:利用Trizol试剂分别提取正常胃黏膜细胞GES-1、胃癌细胞MGC803、MKN-28、SGC-7901和各组AGS细胞的总RNA，并检测其浓度和纯度。利用反转录酶将其反转录为cDNA，并以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。用2-ΔΔCt法计算miR-205-5p和RAP2BmRNA的相对表达量，分别以U6和β-actin为内参。引物序列如下：miR-205-5p-F：5′-TCCTT CATTCCACCGGAGTCTG-3′，miR-205-5p-R：5′-GCG AGCACAGAATTAATACGAC-3′;U6-F：5′-ATTGGA ACGATACAGAGAAGATT-3′，U6-R：5′-GGAACGCTT CACGAATTTG-3′;RAP2B-F：5′-GACGTCGGCCAA AAACAAA-3′，RAP2B-R：5′-CGCACGATCTCGGCA AAT-3′;β-actin-F：5′-TATGCTCTCCCTCACGCCA-3′；β-actin-R：5′-TTTACGGATGTCAACGTCACAC-3′。

1.2.3 双荧光素酶报告基因的检测：利用生物信息软件预测miR-205-5p的靶基因。发现miR-205-5p与WT-3′UTR-RAP2B能够特异性结合，猜测RAP2B是miR-205-5p的靶基因，并利用双荧光素酶报告基因检测进行验证。构建野生型WT-RAP2B和突变型MUT-RAP2B的RAP2B-3′UTR荧光素酶报告基因载体，利用LipofectamineTM2000将miR-205-5p模拟物和miR-con分别与WT-RAP2B和MUT-RAP2B共转染AGS细胞，将各组细胞置于CO2培养箱培养48 h后，利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒对各组AGS细胞的荧光素酶活性进行测定。

1.2.4 MTT法检测细胞活力：将各组细胞按照2×103个/孔，200 μL/孔接种于96孔板，分别于培养后0、24、48和72 h时间点向每孔中加入MTT试剂20 μL，继续孵育4 h，小心吸去孔内上清，每孔再加入150 μL的DMSO试剂，继续孵育2 h，待结晶充分溶解后，用酶标仪在490 nm波长处检测各孔的A值(用空白孔进行调零)，并绘制细胞活力曲线。

1.2.5 Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力：迁移实验，取转染48 h的各组AGS细胞，用胰蛋白酶消化后离心收集细胞，用无血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度。向Transwell下室加入500 μL含10% FBS的RPMI-1640培养基，向上室加入300 μL(约5×104个细胞)的细胞悬液，培养24 h，棉签轻柔擦去上室膜上的细胞，甲醇固定下室膜30 min。晾干后，0.1%的结晶紫溶液染色20 min。洗去多余的染液后，于显微镜下随机选取5个不同视野观察细胞，记录细胞总数，并进行拍照，取均值即为迁移细胞数目。

侵袭实验：采用包被基质胶的Transwell小室，其他步骤同体外迁移实验。

1.2.6 Western blot检测细胞增殖、迁移、侵袭及Wnt/β-catenin信号通路下游相关蛋白的表达：利用RIPA裂解液裂解各组AGS细胞，获得各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量。沸水浴3～5 min使细胞充分变性，取20～30 μg已变性的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，电泳结束后，常规湿法将已分离的细胞蛋白从PAGE胶转至PVDF膜，转膜结束后，用5%脱脂牛奶室温摇床封闭30 min，吸尽封闭液后，用Western blot洗涤液洗膜3次，每次10 min，然后加入已稀释的抗RAP2B、β-actin、cyclin D1、MMP-2、MMP-9、GSK-3β和β-catenin蛋白的一抗，室温孵育2 h后，向已洗涤后的PVDF膜中加入稀释好的二抗，继续室温孵育1 h，ECL显影后进行拍照，并用Image J软件对目的条带进行定量(以β-actin为内参)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 正常胃黏膜细胞和胃癌细胞中miR-205-5p和RAP2B的表达

与正常胃黏膜细胞GES-1相比，胃癌细胞AGS、MGC803、MKN-28和SGC-7901中miR-205-5p的表达显著降低，RAP2BmRNA和RAP2B蛋白的表达显著升高(P<0.05)(图1)。

A.expression level of miR-205-5p in gastric cancer cells; B,C.expression level of RAP2B in gastric cancer cells; *P<0.05 compared with GES-1

2.2 过表达miR-205-5p对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与NC组和miR-con组相比，miR-205-5p组AGS细胞miR-205-5p的表达显著降低(图2A)。与NC组和miR-con组相比，miR-205-5p组AGS细胞在48和72 h时细胞活力显著降低，AGS细胞迁移和侵袭数目显著减少，增殖相关蛋白cyclin D1和迁移侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达均显著减少(P<0.05)(图2B～2E)。

2.3 抑制RAP2B表达对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与NC组和si-con组相比，si-RAP2B组AGS细胞RAP2BmRNA和RAP2B蛋白的表达显著减少(图3A，D)(P<0.05)。与NC组和si-con组相比，si-RAP2B组AGS细胞在48和72 h时细胞活力显著降低(图3B)，AGS细胞迁移和侵袭数目显著减少(图3E)，增殖相关蛋白cyclin D1和迁移侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达均显著减少(图3C，D)(P<0.05)。

2.4 miR-205-5p靶向调控RAP2B表达

miR-205-5p与RAP2B-3′UTR-WT之间存在特异性结合位点(图4A)。野生型RAP2B基因荧光素酶表达载体WT-RAP2B和miR-205-5p mimics共转染AGS细胞后，miR-205-5p组AGS细胞荧光素酶活性较miR-con组明显降低(P<0.05)；而突变型RAP2B基因荧光素酶表达载体MUT-RAP2B和miR-205-5p mimics共转染AGS细胞后，miR-205-5p组AGS细胞荧光素酶活性较miR-con组差异不显著(图4B)。与miR-con组比较，miR-205-5p组AGS细胞RAP2B蛋白的表达量显著减低；与anti-miR-con组比较，anti-miR-205-5p组AGS细胞RAP2B蛋白的表达量显著升高(图4C)(P<0.05)。

2.5 过表达RAP2B可部分逆转过表达miR-205-5p对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用

与miR-con组相比，miR-205-5p组AGS细胞在48 h和72 h时细胞活力显著降低(图5A)，AGS细胞迁移和侵袭数目显著减少(图5D)，RAP2B、cyclin D1、 MMP-2和MMP-9蛋白的表达均显著减少(图5B，C)(P<0.05)。与miR-205-5p+pcDNA组相比，miR-205-5p+pcDNA-RAP2B组AGS细胞在48和72 h时细胞活力显著升高(图5A)，AGS细胞迁移和侵袭数目显著增多(图5D)，RAP2B、cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白的表达均显著升高(图5B，C)(P<0.05)。

A.the expression of miR-205-5p in gastric cancer cells; B.the effect of over-expression of miR-205-5p on the proliferation of gastric cancer cells; C，D.the effect of over-expression of miR-205-5p on the expression of cyclin D1, MMP-2 and MMP-9 in gastric cancer cells； E.over-expression of miR-205-5p affects migration and invasion of gastric cancer cells; *P<0.05 compared with NC group and miR-con group

A.the expression level of RAP2B in gastric cancer cells; B.the effect of knockout RAP2B on the proliferation of gastric cancer cells; C.the effect of RAP2B knockout on the migration and invasion of gastric cancer cells; D.knockout RAP2B on gastric cancer cells RAP2B, cyclin D1, MMP-2 and effect of MMP-9 expression; *P<0.05 compared with NC group and si-con group

A.bioinformatics software predicts the targeting relationship between miR-205-5p and RAP2B; B.dual luciferase reporter gene assay verifies the targeting relationship between miR-205-5p and RAP2B; C.Western blot detects the expression of RAP2B protein; *P<0.05 compared with the miR-con group; #P<0.05 compared with the anti-miR-con group

2.6 miR-205-5p通过调控RAP2B对Wnt/β-catenin信号通路下游相关蛋白GSK-3β和β-catenin表达的影响

与miR-con组相比，miR-205-5p组AGS细胞中β-catenin的表达显著降低，GSK-3β的表达显著升高(图6)；与miR-205-5p+pcDNA组相比，miR-205-5p+ pcDNA-RAP2B组AGS细胞中β-catenin的表达显著升高，GSK-3β的表达显著降低(图6)(P<0.05)。

3 讨论

胃癌是全球导致癌患者死亡的主要原因之一，了解胃癌发生发展的分子机制对临床开展新的治疗方法具有重大意义。miR-205-5p属于miR-205簇成员之一，近年来，miR-205在人类多种疾病中的作用被广泛报道。例如，miR-205-5p在垂体瘤中呈低表达，过表达miR-205-5p可有效抑制垂体瘤细胞的增殖和迁移[8]；miR-205-5p在前列腺癌中也呈低表达，过表达miR-205-5p可抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[9]。相反，miR-205在卵巢癌中表达增加，并促进卵巢癌细胞的存活和侵袭[10]。RAP2B最早分离于人类血小板cDNA文库，其编码的RAP2B蛋白是Ras相关低分子量GTP结合蛋白超家族成员之一。RAP2B在多种肿瘤中呈高表达，并发挥促生存功能[11]。RAP2B在肺癌细胞中表达上调，并促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[12]。然而，miR-205-5p和RAP2B在胃癌中的表达情况及其对胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响目前尚不清楚。基于以上科研背景，便展开以下研究。

A,B.Western blot detected RAP2B, cyclin D1, MMP-2, MMP-9 protein expression; C.MTT detection of gastric cancer cell proliferation; D.Transwell detection of cell migration, invasion; *P<0.05 compared with miR-con group; #P<0.05 compared with the miR-205-5p+pcDNA-com group

*P<0.05 compared with miR-con group; #P<0.05 compared with the miR-205-5p+pcDNA-con group图6 Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路下游相关蛋白GSK-3β和β-catenin表达

本研究首先对正常胃黏膜细胞和4种胃癌细胞中miR-205-5p和RAP2B的表达情况进行检测，结果证实miR-205-5p在胃癌细胞中表达显著下调，RAP2B表达显著上调。进一步研究显示，过表达miR-205-5p或抑制RAP2B表达均可抑制胃癌细胞AGS的增殖、迁移和侵袭，抑制cyclin D1、MMP-2和MMP-9表达。此外，双荧光素酶报告基因实验和Western blot检测证实，miR-205-5p可靶向负性调控RAP2B的表达。提示miR-205-5p通过靶向RAP2B抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。功能回复实验显示，过表达RAP2B可反转miR-205-5p对AGS细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用。Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路是生物进化过程中比较保守的通路，糖原合成激酶3β(GSK-3β)是Wnt信号传导途径的关键酶，GSK-3β可促使β-catenin的磷酸化，β-catenin是Wnt信号通路中有转录调控活性的关键成员，其在胞质内的聚集可激活下游靶基因的转录，进而导致细胞增殖和侵袭异常，是Wnt信号通路激活的主要标志[13-14]。本研究结果显示，过表达miR-205-5p可抑制Wnt/β-catenin信号通路活化。过表达RAP2B可逆转miR-205-5p对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用。以上结果提示，miR-205-5p通过靶向RAP2B抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关，这将是进一步研究的重点。

综上所述，本研究发现miR-205-5p通过靶向RAP2B抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。因此，miR-205-5p有望成为胃癌临床治疗的潜在分子靶点。