以“生肌三法”为代表的方药对糖尿病足伴慢性疮面作用机制的探讨

王广宇 王雨 王雷永 徐旭英

摘要  目的：紫色疽瘡膏、回阳生肌膏、朱红膏是我科生肌三法的代表方药，通过临床研究观察疮面修复中起重要作用的细胞因子TNF-α、VEGF、bFGF变化情况，初步探讨其作用机制。方法：选取2015年1月至2016年5月北京中医医院收治的糖尿病伴慢性疮面患者90例作研究对象，按照局部辨证分为活血生肌组、回阳生肌组和去腐生肌组，每组30例。溃疡中医证侯积分观察治疗0、6、12 d。留取治疗0、3、6 d局部组织及疮面渗出物，检测其中TNF-α、VEGF、bFGF 3种生长因子在渗出物中含量变化，组织中蛋白及mRNA相对量的变化。结果：中医证候积分部有效率为53.3%，组间差异无统计学意义（P=0.428）;中医外用药应用于疮面后，渗出物、组织中蛋白和组织中mRNA表达，TNF-α、VEGF、bFGF 3种生长因子，有着较为一致的检测结果。紫色疽疮膏治疗3 d VEGF、bFGF升高明显，后有所下降，而对TNF-α无明显影响;回阳生肌膏治疗3 d后bFGF、TNF-α后升高明显，6 d时稍有下降，而对VEGF无明显影响;朱红膏对TNF-α、VEGF、bFGF 3种生长因子有缓慢持续的升高作用。结论：观察到紫色疽疮膏影响了VEGF、bFGF;回阳生肌膏方对TNF-α、bFGF有较强的升高作用;朱红膏方对TNF-α、VEGF、bFGF均有缓慢持续的升高，通过调整这些重要的细胞因子，从而改变疮面的状态。

关键词  糖尿病伴慢性疮面;生肌三法;机制;渗出物;生长因子;紫色疽疮膏;回阳生肌膏

Exploration on the Mechanism of Prescriptions of “Three Methods of Promoting Granulation” on Diabetic Foot with Chronic Sores

WANG Guangyu，WANG Yu，WANG Leiyong，XU Xuying

（Vascular Surgery Department of Sore and Ulcer，Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100010，China）

Abstract Objective： Zise Juchuang Ointment，Huiyang Shengji Ointment and Zhuhong Ointment are representative prescriptions of “three methods of promoting granulation” in my department.To preliminarily explore the mechanism through clinical study and observation on changes of TNF-α，VEGF and bFGF that play important roles in sore repair. Methods： A total of 90 patients of diabetes with chronic sores admitted in Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine from January 2015 to May 2016 were selected as study objects.According to local syndrome differentiation，they were divided into invigorating blood and promoting granulation（IBPG）group，restoring yang and promoting granulation（RYPG）group and eliminating necrosis and promoting granulation（ENPG）group，with 30 cases in each group.Ulcer syndrome scores in traditional Chinese medicine（TCM）were observed before the treatment，and on the 6th and 12th days.Local tissue and sore surface exudate were collected before the treatment，and on the 3th and 6th days.Content changes of the 3 growth factors-TNF-α，VEGF and bFGF in the exudate，and relative amount changes of protein and mRNA in the tissue were detected. Results： Effective rate of TCM syndrome score was 53.3%，and there was no statistical significance in the difference between the groups（ P =0.428）.After TCM external application to sores，in the expressions of mRNA in the tissue and protein in the tissue and exudate，as well as in the 3 kinds of growth factors（TNF-α，VEGF and bFGF），the detection results were relatively consistent.After the treatment with Zise Juchuang Ointment for 3 d，VEGF and bFGF were increased significantly，but they were decreased later，and there was no significant effect on TNF-α.After 3 d of the treatment with Huiyang Shengji Ointment，bFGF and TNF-α were increased significantly，and they were decreased on the 6th d，but there was no significant effect on VEGF.Zhuhong Ointment had a slow and sustained increasing effect on the 3 kinds of growth factors（TNF-α，VEGF and bFGF）. Conclusion： It can be observed that Zise Juchuang Ointment may affect VEGF and bFGF; Huiyang Shengji Ointment may strongly increase TNF-α and bFGF; Zhuhong Ointment has a slow and continuous increasing effect on TNF-α，VEGF and bFGF.By adjusting these important cytokines，the state of sores is changed.

Keywords  Diabetes with chronic wounds; Three methods of promoting granulation; Mechanism; Exudate; Growth factor; Zise Juchuang Ointment; Huiyang Shengji Ointment

中图分类号：R255.4;R275.9 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.019

近几十年，糖尿病伴慢性创面日益增多，在长期临床探索中北京中医医院疮疡血管外科（后简称我科）认为，其发生、发展、预后与局部虚（阳气不足）、瘀（血瘀）、毒（热毒）3个病理过程相互转化、互为因果所致。局部破溃后疮面修复过程中以阳虚、血瘀、热毒为主要矛盾的过程，导致久不愈合。我科在继承前人基础上，逐步整理出以回阳、活血、去腐生肌三法为核心的系列理法方药，是糖尿病伴慢性疮面修复的有效手之一。

巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞是创面愈合的炎性反应、增殖、修复3个过程中起重要作用的细胞，其主要由肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor α，TNF-α）、血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）、碱性成纤维因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）3个细胞因子调控。围绕着3种细胞因子的变化，初步探讨以回阳生肌膏方、紫色疽疮膏方、朱红膏方为代表生肌三法方药，对慢性疮面的临床疗效和作用机制，以现代技术为方法作了以下研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月至2016年5月首都医科大学附属北京中医医院收治的糖尿病足伴慢性疮面90例作为研究对象，按照局部辨证方法分为活血生肌组、回阳生肌组和去腐生肌组，每组30例。本临床研究所需标本均为清创后废弃的组织，不影响患者任何正常治疗，并经首都医科大学附属北京中医医院伦理委员会审查和批准，签属知情同意书后措施。

1.2 诊断标准 1）西医诊断标准参照国际糖尿病足工作组（IWGDF，International Working Group on the Diabetic Foot）发布的2015版《国际糖尿病足慢性创面管理指南》，糖尿病伴足部溃疡4周以上未能愈合，也无明显愈合趋势的创面称之为糖尿病足伴慢性创面（DFCUs）[1]。2）局部辨证方法参照《中药新药临床研究指导原则》所示：1）血瘀证：疮面溃烂经久，渗出物较少或干枯无脓，腐肉少许或腐肉虽脱，但新肉难生，疮周肤色暗无红肿;2）阳虚证：疮面灰白色或紫暗，腐肉较多伴有渗出物清稀，或如粉浆，创周无红肿。3）湿热证：疮面渗出较多，腐肉不脱，疮周红肿，界限不清[2]。

1.3 纳入标准  疮面符合上述诊断标准，年龄65～85岁的患者，且非放射性、非结核、非癌性等疮面，疮面面积4～30 cm2，深至皮下组织，但未及骨质。

1.4 排除标准 排除恶性肿瘤、急性心脑血管意外、肾功能不全、严重肝脏损伤等急慢性疾病，

1.5 脱落与剔除标准 在治疗过程中出现创面感染加重，创面扩大，或者出现心脑血意外，或其他影响创面愈合和治疗的因素，或因各种因素退出治疗的，作为脱落对象。

1.6 治疗方法 基础治疗：依据2015版《国际糖尿病足慢性创面管理指南》进行内科处理[1]。外科处理，依据局部辨证活血生肌组、回阳生肌组、去腐生肌组分别应用紫色疽疮膏纱条、回阳生肌膏纱条、朱红膏纱条（3种药物均我院内制剂），纱条剪成合适大小敷于疮面，1次/d，并蚕食清创。

1.7 观察指标

1.7.1 糖尿病足溃疡中医症候积分 依据文献报道进行，评分时间为治疗前及治疗后6 d、12 d，共计观察12 d[3]。治疗前后检测肝肾功能、血尿便常规，记录发生不良事件及计算发生率。

1.7.2 疮面渗出物细胞因子变化 在留取标本前1 d局部凡士林纱布换药。取定制1.5 cm2单层无菌纱布，局部换药时敷于疮面基底，第2天更换敷料时取出，立即放入2 mL无菌生理盐水中，-80 ℃保存、留检。渗出物中细胞因子应用悬浮芯片检测法。每组观察30例，选取适于清创选取组织的患者每组8例进行组织检测。TNF-α、bFGF、VEGF细胞因子检测试验盒（MILLPLEX MAP Human cytokine/chemokine magnetic bead panel试剂盒，批号：2509782）;磁力板架（Millipore，编号：MX-STAND）;悬浮芯片检测仪（Luminex 200TMIS，BIO-RAD）。检测前制备抗体标记微球、质量控制组、清洗缓冲液（Wash Buffer）、人细胞因子标准品。免疫操作过程：按操作规则加入标本，置入Luminex 200TMIS（BIO-RAD）内检测。保存并分析MFI结果，计算盐水中细胞因子浓度代替疮面渗出物细胞因子浓度。

1.7.3 疮面组织中细胞因子蛋白含量变化 留取清创后弃去的组织，为皮肤真皮浅层，立即放入-80 ℃冰箱保存。经50.0 μg/mL GA干预24 h后，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。Western blot检测VEGF、TNF-α和bFGF蛋白表达水平。使用MultiSkan MK3酶标仪（Thermo）进行检测和照相。计算目标蛋白的光密度值，并与GAPDH（YM3030，Immunoway）蛋白质标准化的内参抗体光密度值的比值，进行统计学比较，计算靶蛋白的相对量。

1.7.4 疮面组织中细胞因子基因表达相对量变化  组织留取方法同1.7.3。应用即时PCR法。使用Trizol試剂（Takara，日本）进行总RNA提取。反应体系的总体积是20 μL，补充有5 μL 5×RT缓冲液，5 μL dNTP，0.5 μL RNA模板，5 μL随机引物（oligdt），1 μL逆转录酶M-MLV，0.5 μL RNA酶抑制剂RNAsin，10.5微升水无RNase，变性在42 ℃下进行60 min，退火在95 ℃下进行5 min。TNF-α正向引物GTCAACCTCCTCTCTGCCATCAA，反向引物ATAGATGGGCTCATACCAGGGCTT;VEGF正向引物GAGATGAGCTTCCTACAGCACAACA，反向引物GGAACATTTACACGTCTGCGGATCT;bFGF的正向引物TTCTTCCACAGTCAGGTCAA，反向引物GAGTGGATGGATCTCAATGA。

1.8 疗效判定标准 症候积分减少≥95%为临床痊愈，症候积分减少≥70%为显效，症候积分减少≥30%为有效，症候积分减少<30%为无效。

1.9 统计学方法 采用SPSS 13.0統计软件进行数据分析，计量资料采用（  ±s ）表示，组间比较采用均数间 t 检验;3组间比较采用单因素方差分析，有统计学意义的对3个均数进行组间多重比较 q 检验;计数资料采用行列表资料的χ2检验。以 P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组患者一般情况比较 回阳生肌组疮面病程、CRP、WBC明显高于活血生肌组，去腐生肌组WBC、CRP上明显高于活血生肌组，差异有统计学意义。见表1。

2.2 3组疮面渗出物3种细胞因子变化情况 活血生肌组疮面渗出物VEGF、bFGF在治疗3 d明显升高，VEGF在治疗第6天较第3天明显下降，而bFGF在治疗第6天较第3天明显升高，差异有统计学意义，治疗前后TNF-α无明显变化，差异无统计学意义;回阳生肌组疮面渗出物TNF-α、bFGF在治疗第3天升高明显，TNF-α治疗后第6天较第3天稍有下降，但明显高于治疗前，差异不显著性意义，bFGF治疗第6天较第3天明显下降，差异有统计学意义，但较治疗前差异无统计学意义，VEGF治疗前后均无明显变化，差异无统计学意义;去腐生肌组3种细胞因子在治疗前后均有不同程度缓慢升高，差异有统计学意义。

2.3 3组局部组织中3种细胞因子相对量变化情况  活血生肌组局部组织中VEGF应用后第3天升高明显，与0天比较差异有统计学意义，第6天下降，与0天比较差异无统计学意义，bFGF治疗3、6 d升高明显，差异有统计学意义，TNF-α治疗前后无变化，差异有统计学意义;回阳生肌膏组局部组织中TNF-α、bFGF第3天升高明显，差异有统计学意义，第6天有所下降，与第0天比较差异无统计学意义;去腐生肌组中3种细胞因子均持续升高，3 d与0 d、6 d与3 d比较均有升高，差异有统计学意义。见表3、图1。

2.4 3组疮面组织中3种细胞因子基因表达相对量变化情况 活血生肌组疮面VEGF应用第3天升高明显，bFGF应用3 d、6 d后均升高明显，差异有统计学意义;回阳生肌组中TNF-α、bFGF第3天升高明显，差异有统计学意义，bFGF第6天有所下降，与第3天比较差异有统计学意义，TNF-α第6天下降，但仍较第3天升高，差异有统计学意义;去腐生肌组疮面3种细胞因子均有所升高，并且第6天明显高于第3天，差异有统计学意义。见表4。

2.5 3组局部辨证中医证候积分变化情况 所选患者证候积总有效率为53.3%，行列表资料的χ2验各组间P=0.428，各组间差异无统计学意义。见表5。

2.6 安全性分析 3组患者治疗前后行血尿常规和肝肾功能等常规检查，未见应用药物后对上述指标有不良影响。与药物有关的不良反应均为疮周皮疹，朱红膏1例，回阳生肌膏1例，总的不良反应发生率为2.2%，均能够坚持而未中断局部用药治疗。

3 讨论

糖尿病伴慢性疮面总属阴疽范畴[4]，阴疽病名最早载于南北朝伤科医书《刘涓子鬼遗方》：“阴疽发髀，若阴股始发，腰强，内不能自止，数饮不能多，五日坚痛不治，三岁死”，说明其慢性难愈的特点。“脓为气血所化生”，脓液清稀量少，总以阳衰阴寒，气血虚衰为主，回阳可治;干涸量极少，因气血瘀滞而以活血生肌为法;脓液量不足，疮周红肿总以气血不足以托毒外出，局部去除热毒为要[5]。初步概括出慢性疮面的局部辨证要点，具备了生肌三法的雏形。

回阳生肌膏方组成：肉桂、炮姜、人参芦、白芍、当归，白芥子、蕲艾、黄芪，白蔹，其3组药物质量比为1∶ 3∶ 1.5。方中君以黄芪、当归益气补血而不滞，臣以人参芦增加益气之效，臣以肉桂、炮姜、蕲艾温阳散寒通络，阳气虚损不能温化寒湿痰瘀，佐以白芥子温阳豁痰祛湿，另佐白芍收敛气血以阻其耗散，白蔹寒以制温补、凉以解其毒为使。功在益气养血、回阳生肌[6]。紫色疽疮膏方组成：龙血竭、轻粉、红粉、琥珀粉、乳香粉，冰片、煅珍珠粉，2组各药物比为10∶ 1。方中以龙血竭活血化瘀为君药，臣以琥珀粉、乳香粉增强化瘀之力，臣以红粉、轻粉味辛，去腐拔毒促进生肌，佐珍珠粉具有收敛生肌之效，以防过度辛散耗气。使以冰片增加通散之功。全方主以活血化瘀生肌，并兼去腐解毒、煨脓长肉之功[7]。朱红膏方组成：京红粉，朱砂，基质为凡士林，每100 g药物中含有生药19 g。二者主要含有的硫化汞和氧化汞是化腐生肌的主药。朱砂性寒味甘功专解毒，红粉辛热功擅化腐，二药一文一武，一阴一阳，功效相伍为用，药性相互制约，总为去腐生肌，兼有活血化瘀之效[8]。

文献表明高血糖所致下：1）血管内皮细胞的血管新生、趋化作用、舒缩功能明显异常[9];2）增加了单核细胞的黏附作用而导致迁移、趋化作用减弱[10];3）成纤维细胞增殖、分裂能力下降[11];4）较早的文献观察到，疮面局部巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞出现数量、形态的改变[12-13]。

结合我科既往研究，依据生肌三法理论，局部辨证所示典型阳虚证、血瘀证、湿热证的疮面，代表了糖尿病伴慢性疮面中的虚瘀毒3个基本病理过程，它们互相影响、互为因果、相互转换，疮面发展某一阶段为主要矛盾[14]。

见表1一般资料看，阳虚证疮面伴有轻度炎性反应，气血不足以全部托毒外出，停滞于局部功能和数量下降的状态，所以缠绵难愈病程较长，湿热证疮面仍属阴中之阳证，炎性反应较阳虚证为重，疮面停滞于慢性炎性反应状态，而血瘀证疮面炎性反应及病程方面并不突出，局部停滞于循环障碍状态。

依据图1和表3所示皮下组织中细胞因子应用药物后变化规律。活血生肌组应用紫色疽疮膏方后，可检测在治疗6 d中对TNF-α影响不大，但VEGF在第3天有较为明显的升高，第6天有明显下降的过程，bFGF有着相类似变化过程;阳虚证回阳生肌组应用回阳生肌膏方第3天疮面TNF-α、bFGF有着明显的升高，到第6天再下降的过程，但对VEGF影响不大;湿热证疮面应用朱红膏方TNF-α、VEGF、bFGF3种生长因子3、6有缓慢持续的增多的过程;伴随着渗出物生长因子的变化，其组织中相同生长因子蛋白及其PCR基因相对表达量有着相一致的变化规律，可见3种药物作用于疮面局部，通过某种方式启动了这些相关蛋白的表达，这些细胞因子的增加促进了细胞功能变化，起到愈合疮面的过程。

结果也显示，其总的有效率偏低，3组间差异无统计学意义，但是本研究观察疮面12 d，应用后疮面均能在短时间内渗出物增加，且较为稠厚，腐肉去而肉芽增生，使瘡面虚瘀毒不同状态得到明显改善，改善疮面主要矛盾，就是证型的改变，启动愈合生肌的趋势，这才是慢性难愈合疮面治疗的重点。

综上所述，3种外用药物可能机制，紫色疽疮膏增加了VEGF、bFGF;回阳生肌膏方对TNF-α、bFGF有较强的刺激作用;朱红膏方对TNF-α、VEGF、bFGF均有缓慢持续的升高[15]。通过调整这些重要的细胞因子，从而改变疮面的状态，显现出中医外用药的相对专一和相对综合的作用。

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（2018-10-17收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：国家自然科学基金项目（81673975）——回阳生肌膏促进2型糖尿病溃疡微血管形成的作用机制研究;首都中医药研究专项一般项目（15ZY16）——紫色疽疮膏促进溃疡局部微循环变化的机制研究;北京中医药科技项目（WAF2012-13）——生肌三法促进疮面愈合的机制研究

作者简介：王广宇（1971.12—），男，硕士研究生，副主任医师，研究方向：中医外用药对慢性创面修复的研究，E-mail：wgy0503@sina.com

通信作者：徐旭英（1973.04—），男，博士研究生，主任医师，研究方向：中医药对慢性创面修复的机制研究，E-mail：xxying7341@126.com