基于网络药理学研究女贞子-淫羊藿药对活性成分抗骨质疏松的分子机制

陈楠 宋红 沙南南 王拥军,3 张岩,3*

1.上海中医药大学附属龙华医院，上海 2000322.贵州省骨科医院，贵州 贵阳 5500023.教育部筋骨理论与治法重点实验室，上海 200032

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种常见的骨代谢疾病，其主要特征为骨密度降低和骨微结构破坏[1-2]。据估计，全世界约有30%的妇女和12%的男性受到OP的影响，全球每年会有890万人发生骨折[3-4]。但是在临床药物只能发挥改善症状的作用，并不能有效抑制OP的进一步发展[5]。随着中医药事业的发展，中药在治疗OP方面的多成分、多机制的优势也逐渐被发掘出来，所以从OP的发生机制上寻找中药中的有效成分，并做出科学阐述，能够发挥传统中药在治疗OP方面的独特优势。

女贞子为木犀科植物女贞的干燥成熟果实，首次记载于《神农本草经》，具有滋补肝肾、养血益阴的作用，用于临床治疗OP也有千年历史上[6-7]。现代科学研究发现，中药女贞子化学成分多达100多种，其中以多糖、黄酮类等为主[8]。具有多种药理作用，包括抗OP[9]、抗氧化[10]、抗衰老[11]、抗癌[12]、抗糖尿病[13]等。中药淫羊藿为小檗科淫羊藿属植物，最初记载于《神农本草经》，主要发挥补足肾阳、强健筋骨作用，应用广泛[14]。同时研究发现，淫羊藿含有260多种有效成分，包括黄酮、多糖、生物碱等[15]。淫羊藿药理学作用包括抗OP、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化[16]。有研究表明[17-18]，女贞子和淫羊藿的药对配伍对OP有很大的改善和治疗作用，所以揭示其分子机制也有利于女贞子-淫羊藿药对基础和临床的使用及推广。

1 资料与方法

1.1 女贞子-淫羊藿中活性成分的筛选

TCMSP数据库中收录约502味中药，及对应约12 144个相关中药成分，并对每个中药的化合物按照药代动力学参数进行分类，同时对应上相关疾病[19]。本研究通过检索TCMSP数据库，分别以女贞子和淫羊藿为关键词，其中筛选条件设置为类药性(DL)≥ 0.18、口服生物吸收利用度(OB)≥30%，将获取的女贞子和淫羊藿的所有活性成分进行查重和整合。

1.2 疾病靶点的获取

DrugBank数据库是包含有关药物及其机制的全面分子信息[20](同时还包括DisGeNET[21]、TTD[22]、OMIM 数据库[23]、GAD数据库[24]、PharmGKB数据库[25]、GeneCards数据库[26])，设置“osteoporosis”为关键词在以上7个数据库中进行检索，并对检索结果进行整理，查重和整合所有靶点即为OP的所有已知靶点。

1.3 中药活性成分和疾病靶点基因的获取

使用UniProt数据库[27]，种族设置为Human，查询中药活性成分和疾病靶点对应靶点，将OP已知相关靶点使用UniProt查出对应靶点基因，并绘制维恩图获得女贞子-淫羊藿活性成分潜在抗OP的作用靶点基因。

1.4 女贞子与淫羊藿“活性成分-靶点基因网络”的构建

用软件Cytoscape3.7.1对其进行构造，作网络可视化分析图[28]。将从上述获得的女贞子与淫羊藿的有效活性成分和靶点基因导入软件Cytoscape3.7.1，筛选出女贞子-淫羊藿有效活性成分及其对应靶点基因，同时结合文献研究，整理和分析其中的相互作用。

1.5 关键靶点生物功能注释及通路分析

DAVID是一个信息数据库，可以对靶点的功能和通路进行KEGG通路分析，通过信号通路对疾病阐述中药的独特优势[29]。在DAVID数据库中依次输入女贞子、淫羊藿和OP的关键靶点，在通路分析选项设置KEGG，以P<0.05为标准进行信号通路筛选。

2 结果

2.1 女贞子-淫羊藿有效活性成分的筛选

通过TCMSP数据库，检索发现女贞子化学成分共有119个，淫羊藿化学成分共有130个，通过DL≥0.18和OB≥30%进一步筛选得到其潜在活性化合物，其中女贞子有13个，淫羊藿有23个(表1)，使用Draw Venn Diagram平台将中药活性成分划分并绘制维恩图(图1)。

图1 女贞子-淫羊藿中潜在活性成分维恩图Fig.1 Venn diagram of potential active components in Ligustrum lucidum and Epimedium

表1 女贞子-淫羊藿中潜在活性成分DL和OB值及其化学结构式Table 1 DL and OB values and chemical structure formula of potential active components in Ligustrum lucidum and Epimedium

续表1 女贞子-淫羊藿中潜在活性成分DL和OB值及其化学结构式Continued table 1 DL and OB values and chemical structure formula of potential active components in Ligustrum lucidum and Epimedium

2.2 女贞子与淫羊藿活性成分-靶点网络图

将女贞子和淫羊藿的33个潜在活性成分，及其对应的227个靶点进行构建网络图，见图2。

图2 中药生物活性成分-靶点网络图Fig.2 Network diagram of bioactive components and targets of traditional Chinese medicine注：两个八边形：女贞子、淫羊藿两味中药；外圈圆形：潜在活性成分；中间四边形：潜在活性成分对应靶点基因。

2.3 疾病-靶点网络图

将OP与其对应的190个靶点基因进行构建网络图，见图3。

图3 OP-靶点基因网络图Fig.3 OP target gene network注：中间圆形：骨质疏松；四周为骨质疏松治疗的潜在靶点基因。

2.4 女贞子-淫羊藿成分抗OP的潜在作用靶点预测

将女贞子-淫羊藿成分靶点使用UniProt得到对应靶点基因，查重和整合得到女贞子和淫羊藿活性成分靶点基因各190个、216个[30]。绘制维恩图将药物与骨质疏松症对应靶点基因188个进行分析(图4)，最终获得共同基因16个，其中归属女贞子的有15个，分别为TGFβ1、PGR、AR、ESR1、COL1A1、CA2、PPARG、NOS3、CYP3A4、TNF、STAT1、SELE、RUNX2、THBD、HK2；归属于淫羊藿的有15个，分别为TGFβ1、PGR、AR、ESR1、COL1A1、ESR2、PPARG、NOS3、CYP3A4、TNF、STAT1、SELE、RUNX2、THBD、HK2；两者间共同靶点为14个，分别为TGFβ1、PGR、AR、ESR1、COL1A1、PPARG、NOS3、CYP3A4、TNF、STAT1、SELE、RUNX2、THBD、HK2。这提示女贞子与淫羊藿在抗OP治疗过程中大多为共同的作用靶点发挥作用，同时又有其自己关键作用靶点可单独发挥作用，两药可协同发挥抗OP作用。

图4 女贞子-淫羊藿-OP靶点基因维恩图Fig.4 Venn map of target gene of privet fructus ligustri lucidi-herba epimedii maxim-OP

2.5 药物-活性成分-关键作用靶点网络构建与分析

对女贞子-淫羊藿以及OP疾病共有靶点基因进行桥接，共获得有效成分18个，有效靶点基因16个，见图5。

图5 中药生物关键活性成分-OP靶点网络图Fig.5 Target network diagram of OP, a key bioactive component of traditional Chinese medicine注：上面两个八边形：女贞子、淫羊藿两味中药；中间四边形：有效成分；下面圆形：有效靶点基因。

2.6 女贞子-淫羊藿治疗OP机制通路分析

KEGG通路富集分析女贞子-淫羊藿的14个潜在关键靶点基因，发现共有12条信号通路发挥作用(图6)，其中选择相关性最大的前10条通路分别为破骨细胞分化通路(图7)、癌症途径、癌症的蛋白多糖通路、结核病通路、乙型肝炎通路、弓形虫病通路、阿米巴病通路、利什曼病通路、炎症性肠病通路、疟疾通路、非洲锥虫病通路、II型糖尿病通路，表明女贞子-淫羊藿药对可能通过这些信号通路协调发挥抗OP作用。采用OmicShare对通路进行分析，结果发现女贞子-淫羊藿药对关键靶点基因富集于多种OP通路上，提示此通路可作为未来研究女贞子-淫羊藿抗OP的重要方向。

图6 女贞子-淫羊藿抗OP的信号通路富集分析Fig.6 Enrichment analysis of anti OP signal pathway of Ligustrum lucidum and Epimedium

图7 女贞子-淫羊藿抗OP的KEGG信号通路Fig.7 KEGG signaling pathway of Ligustrum lucidum-Epimedium against OP注：粗框：女贞子和淫羊藿药对治疗OP的有效靶点。

3 讨论

基于中医“肾藏精，主骨、生髓”理论，肾虚是OP症的主要发病机制[31]。女贞子、淫羊藿作为两味常用治疗肾虚中药，其中女贞子以治疗肾阴虚为主，淫羊藿以治疗肾阳虚为主，以“阴阳双补，益精壮骨”的立法将二者配伍用于临床治疗OP已接近50年之久[32]。目前许多临床研究认为女贞子-淫羊藿药对在治疗糖皮质激素所致OP方面疗效显著[33]，同时女贞子-淫羊藿药对在调节患者机体免疫功能和预防疾病作用明显[34-35]。

通过本研究中所有网络图显示，山奈酚(kaempferol)及槲皮素(quercetin)为女贞子和淫羊藿共有活性成分，除此之外还有淫羊藿苷(icariin)、去水淫羊藿黄素(anhydroicaritin)和木犀草素(luteolin)均为网络中的重要节点，说明这些潜在有效化合物在女贞子-淫羊藿药对抗OP治疗中发挥着重要作用，这与目前的基础和临床的相关研究结果基本保持一致，同时也提高了本研究中对预测结果的可信度。研究表明山奈酚可以显著抑制去卵巢(OVX)大鼠骨吸收，改善骨小梁微结构[36]，而且山奈酚可以减缓OVX模型后引起的体重增加，并且不会引起子宫内膜肥大[37]。共有活性成分槲皮素可以使糖皮质激素诱导的OP症大鼠的股骨骨小梁密度和皮质骨骨厚度增加[38]。也有文献指出[39]，当给药TNF-α刺激骨髓间充质干细胞(BMSCs)时，会诱导BMSCs的核因子κB(NF-κB)的激活和β-连环蛋白的降解，而此时可以通过槲皮素抑制这个过程，并促进BMSCs增殖和其向成骨分化，增加成骨细胞。维生素D受体(VDR)的激活被认为是治疗OP的潜在药物靶标，有研究报道槲皮素可以激活VDR与配体结合的结构域。此外，该研究还证实槲皮素提高了Caco-2细胞中VDR靶基因TRPV6 mRNA表达水平。以上结果表明，槲皮素可作为VDR的激动剂起到抗OP作用[40]。

本研究通过药物有效活性成分及其对应靶点和疾病靶点的对应匹配构建的网络图，最终获取得到女贞子-淫羊藿药对在治疗OP方面的关键靶点基因共16个，其中女贞子15个，淫羊藿15个，两者共有的靶点有14个，进一步发现有效的治疗靶点蛋白有TNF、PPARG、STAT1、TGFB1，而这4个关键靶点在抗骨质疏松的信号通路中均占有重要地位，可作为女贞子-淫羊藿药对抗OP的重要靶点蛋白。在KEGG 信号通路富集分析的结构中也显示，这4个关键靶点富集的通路主要为破骨细胞分化通路等，结合目前基础和临床的研究中，女贞子-淫羊藿的配伍发挥抗OP机制及所对应的通路中都有所体现。KEGG信号通路富集分析结果也表明女贞子-淫羊藿药对的多种活性成分对应的关键靶点作用于多种有效通路，正符合中医药独特优势，不同成分、靶点和通路之间的相互协调共同发挥治疗OP的作用，初步证明女贞子和淫羊藿配伍治疗OP的科学性，为进一步深入探讨其作用机制以及研发防治骨质疏松新药提供了新方向。