盐酸二甲双胍抑制破骨细胞分化的研究

周琳 杨明理 曾春平* 龙涛 樊秀云

1.广州医科大学附属第五医院内分泌科，广州医科大学第五临床学院，广东 广州 5107002.遵义医科大学医学遗传学教研室，贵州 遵义 563000

骨重建包括骨形成和骨吸收两种相互平衡的过程，分别由成骨细胞和破骨细胞调控[1]。破骨细胞的过度作用导致骨吸收增多，打破骨形成和骨吸收的平衡，将引起如骨质疏松症等疾病，破骨细胞在这类疾病中的作用非常关键[2]。目前发现，各型糖尿病使骨质疏松症发病风险增高[3]。运用降糖药物降低血糖后，骨折风险可明显降低，这些降糖药物中，二甲双胍降低骨折风险最为明显，且矫正了降糖的作用后，二甲双胍仍具有降低骨折风险的作用[4]。目前的研究表明，二甲双胍通过促进成骨细胞分化[5-7]，增强成骨细胞的功能来增加骨密度，然而二甲双胍对破骨细胞的作用罕见有文献报道。本课题组研究盐酸二甲双胍对破骨细胞分化及功能的作用，从而为骨质疏松症提供潜在的治疗手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

α-MEM 培养基和胎牛血清购自澳大利亚 TRACE 公司，RANKL、MCSF、TRAP试剂盒购自北京索莱宝公司，盐酸二甲双胍(纯度>98%)购自美国Sigma公司。辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗购自美国santo cruz公司。抗ERK抗体购自美国cell signaling公司。骨吸收板购自美国BD公司。TRIZOL购买于美国invitrogen公司，Real-time PCR反应试剂SYBR®Premix Ex Taq购于大连TaKaRa。

1.2 细胞培养

分离取出C57BL/6小鼠股骨的骨髓巨噬细胞种于75 cm2的培养瓶中。培养瓶内含10 mL 10%胎牛血清的α-MEM培养基和25 ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)。于培养箱中培养3 d至后种于96孔板中，每孔6 000个细胞，含100 μL完全培养基、25 ng/mL MCSF，以及50 ng/mL RANKL。同时加入不同浓度的盐酸二甲双胍(6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 μmol/L)，每2 d换一次培养液，总共培养5 d。5 d后细胞固定30 min，加入抗酒石酸酸性磷酸酶染料(TRAP)染色15 min，然后用10倍镜下数破骨细胞数量(对细胞核大于3的破骨细胞进行计数)。

1.3 破骨细胞骨吸收活性检测

在6孔胶质板上用RANKL诱导C57BL/6小鼠骨髓巨噬细胞成为成熟的破骨细胞，消化获取细胞后种于覆盖有羟基石灰石的骨吸收板上，每孔1×105个细胞，含2 mL完全培养基、25 ng/mL MCSF，以及50 ng/mL RANKL，并加入不同浓度的盐酸二甲双胍(200、400 μmol/L)。培养48 h后，取一半细胞进行TRAP染色，另一半细胞用10%的漂白液洗去培养板上的细胞，然后用显微镜对骨吸收陷窝进行拍照，并用Image J 计算骨吸收面积。

1.4 破骨细胞基因检测

用实时荧光定量PCR检测破骨细胞特异基因。小鼠骨髓巨噬细胞接种于6孔板，每孔1×105个细胞，含2 mL完全培养基、25 ng/mL MCSF，以及50 ng/mL RANKL，并加入不同浓度的盐酸二甲双胍(100、200 μmol/L)。隔天换液，培养5 d，然后用TRIZOL裂解细胞。用1 μg 总RNA通过oligo-dT引物逆转录成cDNA，然后用SYBR©Premix Ex Taq于实时荧光定量RT-PCR仪进行实时荧光定量PCR反应，检测破骨细胞基因的扩增情况。针对小鼠基因序列的引物设计如下：Cathepsin K(forward：5’-GGGAGAAAAACCTGAAG-3’；reverse： 5’-ATTCTGGGGACTCAGAGAGC-3’)；Calcitonin Receptor (forward： 5’-TGGTTG AGGTTGT GCCCA-3’；reverse：5’-CTCGTGGGTTTGCCTCATC-3’)；TRAP (forward： 5’-TGT GGCCAT CTTTATGCT-3’；reverse：5’-GTCATTTCTTTGGGGCTT-3’)。实时荧光定量PCR反应的反应条件如下：94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 40 s并进行30个循环，接着60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，最后72 ℃ 5 min。

1.5 Western blot 分析

小鼠骨髓巨噬细胞接种于6孔板，每孔1×105个细胞，含2 mL完全培养基、25 ng/mL MCSF，然后加入盐酸二甲双胍(200 μmol/L)处理4 h，然后用50 ng/mL RANKL分别刺激0、5、10、20、30、60 min后弃去培养基，并提取细胞裂解液。然后用相应抗体检测二甲双胍对ERK磷酸化的影响。并用NBT/BCIP显色，凝胶成像系统扫描成像，Image J分析蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件包进行数据分析。实验组与各自的对照组进行两两比较，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 盐酸二甲双胍对破骨细胞分化的影响

本实验通过C57BL/6小鼠股骨分离出的骨髓巨噬细胞培养分化成破骨细胞并进行TRAP染色来进行研究盐酸二甲双胍对破骨细胞分化的影响。本实验采用浓度为6.25～400 μmol/L的盐酸二甲双胍进行干预破骨细胞的分化。研究表明，盐酸二甲双胍能抑制破骨细胞分化，且这种抑制呈浓度依耐性。盐酸二甲双胍从50 μmol/L的浓度开始抑制破骨细胞分化，IC50在100 μmol/L(图1)。

图1 盐酸二甲双胍对破骨细胞分化的作用 A：盐酸二甲双胍的分子结果(分子式：C4H12ClN5，分子量：165.6246)；B：不同浓度盐酸二甲双胍干预破骨细胞分化的细胞培养板的扫描图片；C：100倍显微镜下观察不同浓度盐酸二甲双胍干预破骨细胞分化；D：对盐酸二甲双胍干预的破骨细胞进行计数(对细胞核大于3的破骨细胞进行计数)。Fig.1 The effect of metformin hydrochloride on osteoclast differentiation. A: The molecular structure of metformin hydrochloride (molecular formula: C4H12ClN5, molecular weight: 165.6246); B: The scanned picture of the cell culture plate interfered by different concentrations of metformin hydrochloride; C: Microscopy (100×) observation of osteoclast differentiation interfered by different concentrations of metformin hydrochloride; D: Calculation of osteoclasts interfered by metformin hydrochloride (osteoclasts with cell nucleus≥3 will be calculated only).

2.2 盐酸二甲双胍对破骨细胞功能的影响

盐酸二甲双胍对破骨细胞功能的影响通过覆盖有羟基石灰石的骨吸收板来进行研究。本实验用盐酸二甲双胍干预破骨细胞骨陷窝的形成，然后用显微镜对骨吸收陷窝进行拍照，并用Image J计算骨吸收面积。结果表明，盐酸二甲双胍能在100 μmol/L及200 μmol/L抑制骨吸收陷窝，且这种抑制呈浓度依耐性(图2)，因此对破骨细胞的功能有抑制作用。

图2 盐酸二甲双胍对破骨细胞功能的作用，采用覆盖有羟基石灰石的骨吸收板上分析盐酸二甲双胍对破骨细胞陷窝的作用Fig.2 The effect of metformin hydrochloride on the function of osteoclasts, hydroxyapatite-coated plates were applied for the study of the effect of metformin hydrochloride on osteoclast lacunae

2.3 盐酸二甲双胍对破骨细胞特异基因的影响

本实验用实时荧光定量PCR检测盐酸二甲双胍对破骨细胞特异基因的影响。用不同浓度的盐酸二甲双胍(100、200 μmol/L)干预破骨细胞分化，然后检测破骨细胞特异基因(Cathepsin K、Calcitonin Receptor、TRAP)的表达情况。结果表明，盐酸二甲双胍能在100 μmol/L及200 μmol/L抑制破骨细胞特异基因(Cathepsin K、Calcitonin Receptor、TRAP)，且这种抑制呈浓度依耐性(图3)。该结果与盐酸二甲双胍对破骨细胞的分化及功能具有抑制作用的结果相符合。

图3 盐酸二甲双胍对破骨细胞特异基因的作用Fig.3 The effect of metformin hydrochloride on osteoclast specific genes

2.4 盐酸二甲双胍对ERK磷酸化的影响

本实验用Western blot检测盐酸二甲双胍对ERK磷酸化的影响。盐酸二甲双胍(200 μmol/L)处理4 h，然后用50 ng/mL RANKL分别刺激0、5、10、20、30、60 min后弃去培养基，并提取细胞裂解液进行Western blot分析。结果表明盐酸二甲双胍能抑制ERK的磷酸化(图4)。

图4 盐酸二甲双胍对ERK磷酸化的作用Fig.4 The effect of metformin hydrochloride on the phosphorylation of ERK

3 讨论

随着世界人口的老龄化，骨质疏松症已经成为影响全球人口生活质量和生命健康安全的重要疾病。因骨质疏松症导致髋骨骨折患者1年内的死亡率可以提高8.4～36个百分点[8]。骨质疏松症所导致的骨折给患者带来极大的痛苦，给患者和家庭乃至整个社会带来沉重的负担。目前临床上治疗骨质疏松的药物如双膦酸盐对胃肠道有较大的刺激；甲状旁腺激素需每天经皮下注射，且费用昂贵；补充钙剂和维生素D3对骨质疏松的疗效并不明显。因此，寻求抗骨质疏松疗效显著，副作用小，且能够长期使用的药物对改善骨质疏松症患者的生活质量意义重大。

盐酸二甲双胍是目前治疗糖尿病的一线药物，具有高效性及低副作用性。目前的文献报道盐酸二甲双胍除了降糖作用，还具有抗炎、抗肿瘤、降血脂及心脏保护等作用[9]。盐酸二甲双胍近来还被发现在糖尿病骨质疏松模型大鼠及糖尿病性骨质疏松症患者中均具有抑制骨质疏松，提高骨密度，降低骨折风险的作用[10-11]。目前研究表明二甲双胍通过促进成骨细胞分化，增强成骨细胞的功能来增加骨密度[5-7]，然而二甲双胍对破骨细胞的作用罕见有文献报道。本实验表明盐酸二甲双胍随浓度升高对破骨细胞的分化及功能具有抑制作用，该作用与抑制ERK磷酸化有关。综上所述，本研究为盐酸二甲双胍应用于骨质疏松症的治疗提供了研究基础和实验依据。