川续断提取物续断皂苷Ⅵ防治骨质疏松症的研究进展

赵金龙 梁桂洪 韩燕鸿 潘建科 曾令烽 李嘉晖 赵第 刘军*

1.广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 5104052.广东省中医药科学院骨与关节退变及损伤研究团队，广东 广州 5101203.广州中医药大学第二附属医院(广东省中医院)，广东 广州 510120

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以低骨量和骨组织的微结构退化，导致骨骼脆弱性增强和骨折风险增加为临床特征的一类全身性代谢性骨骼疾病[1-2]。OP为临床常见且难于治疗的骨代谢性疾病，其继发性疾病可致残、致死，如骨质疏松性骨折、严重髋部骨折后卧床引发的并发症、影响呼吸系统等[3]，影响老年人的健康生存质量。目前，我国超过60岁以上人口已达2.1亿，65岁以上人口约1.4亿，老年人口绝对数目已经世界第一，随着人口老龄化的发展，OP已成为我国面临的重要公共健康问题[4-5]。骨代谢平衡状态直接影响骨质疏松症的发生发展，根据骨质疏松的发生机制，临床用药主要以促进骨形成或抑制骨吸收作为主要的治疗思路[6]，但目前临床所应用的抗骨质疏松药物均存在不同程度的缺陷，临床上使用的抗骨质疏松药物均具有一定的不良反应[7-8]。现代药理学研究结果发现[9-10]，川续断在抗骨质疏松领域具有较好的临床疗效，其中其主要化学单体续断皂苷Ⅵ(asperosaponin Ⅵ)，又名木通皂苷D(akebia saponin D，ASD)，具有较强的抗OP功效[11-12]。本综述将从ASD治疗骨质疏松的细胞水平层面及相关生物学通路进行分析总结，以期为今后的ASD抗骨质疏松相关动物实验、临床研究提供一定的指导，进而为ASD等中药单体抗骨质疏松的精准、靶向治疗提供一定的参考。

1 续断和ASD的提取

1.1 续断

续断为中医药学补阳之要药，为多年生草本植物川续断Dipsacus asper Wall. Ex Henry的干燥根，性温，味苦、甘，归肝肾经，入药可补肝肾，强筋骨，续折伤，止崩漏[13]。本药首次记载于《神农本草经》：“主伤寒，补不足，金疮，痈疡，折跌，续筋骨，妇人乳难”。《神农本草疏》云：“入足厥阴、少阴，为治胎产，续绝伤，补不足，疗金疮，理腰肾之要药也”。《本草汇言》称：“续断，补续血脉之药也”“所伤之筋，非此不养”。以上古籍记载均肯定了续断治疗骨伤科疾病的作用，现代临床上续断也被广泛应用于骨质疏松症、骨关节炎等[13-14]。中医药学认为，续断可以补益肝肾，强筋健骨，可用于治疗风湿痹痛、疗筋续断。现代研究结果表明[15]，续断具有改善免疫、促进骨损伤愈合、抗菌、抗炎等作用。高歌等[16]研究发现，续断可能是通过AKT1、MAPK1等影响PI3K-AKT生物学通路，参与破骨细胞的调控，进而起到抗骨质疏松的生物学效应。

1.2 ASD的提取及现代提取工艺研究

ASD的提取一般采用超声法或回流法，朱海琳等[17]认为在单因素试验中，超声法及回流法对ASD提取的转移率没有明显差异。乙醇回流法也被广泛应用于ASD的提取工艺中，但乙醇或其他醇类回流法的提取过程中会消耗大量乙醇等溶剂，此种提取方法耗费较大的经济成本，但具有效率高、周期短、后期处理方便等优点[18]。古丹丹等[19]采用单因素实验与正交试验相结合的方法，结果发现乙醇回流提取ASD具有较高的效率以及可操作性，该实验以ASD转移率为评价标准，其研究认为ASD在乙醇回流法中最佳的提取方法是使用6倍浓度为65%的乙醇共提取3次，每次2 h，该实验中采用此种提取方法得出的ASD转移率为101.52%。超声法在中药成分的提取应用中，体现出了具有提取时间短、提出率高、设备简单等益处，在中药成分的提取应用中得到广泛的认可[20]。朱海琳等[21]采用响应面法进一步优化续断ASD的超声提取工艺进行研究，以ASD转移率为评价标准，根据相关的实验数据及数学方程式确定ASD的最佳提取工艺参数：超声时间 33.13 min，乙醇浓度51.58%，液料比23.39 mL/g，该研究中采用该实验参数得到的ASD转移率为(88.39±0.21)%，该研究进一步为超声提取方法的工艺参数提供了可靠的依据，为进一步的ASD提取工艺发展及其他中药成分的提取提供了借鉴。

2 ASD促进骨形成研究

2.1 ASD对BMSCs成骨分化及相关信号通路研究

OP是由于成骨细胞(osteoblasts，OB)活性的减弱或破骨细胞活性的增加而导致骨骼密度的减少、骨骼脆性增加。成骨细胞的生物学过程与骨质疏松的发生发展密切相连，而成骨细胞的重要来源为骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)，BMSCs在相关的转录因子及细胞因子的推动下，能够进一步分化为成骨细胞，从而促进骨形成[12,18]，可见BMSCs在人类骨骼代谢中至关重要。Cai等[22]研究人员认为BMSCs与OP的发生发展关系密切，BMSCs的分化程度可能直接影响OP的发展进程，因此对BMSCs的生物学过程向着有利于控制骨质疏松方向进行调控，可以作为防治骨质疏松的思路和手段。李家等[23]研究人员发现ASD可以促进BMSCs的分化，提升BMSCs的细胞活力，从而促进骨形成，增加骨量，改善骨小梁的微观结构。相关基础实验发现[24]，ASD可以促进大鼠体外MSCs向成骨细胞方向进行增值分化，从而促进骨形成，防治骨质疏松，该生物学效应的发挥可能与其升高Cbfa1 mRNA的表达有一定联系。

黄媛等[25]认为ASD可以诱导BMSCs分化成为成骨细胞，其中c-Jun和转录激活因子4(ATF4)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)在其中发挥了关键性作用，可能与BMP-2在一定程度上诱导c-Jun等的磷酸化，激活了JNK信号通路，在其研究中通过抑制JNK通路，成骨细胞的分化、骨钙素的表达及ALP活性均受到不同程度的抑制，因此认为ASD可以通过JNK信号通路促进BMSCs分化，从而防治骨质疏松。另有相关研究认为[23]，ASD促进了BMSCs的成骨分化，其中Wnt信号通路可能发挥了较重要的作用，ASD可以升高BMP-2、Runx2等基因的表达，而Wnt信号阻断剂可以阻断或减少此类成骨基因的作用，基于此原理，ASD可能是通过干预Wnt通路，削减Wnt信号阻断剂的作用，促进相关成骨基因的表达，起到增加骨量、改善骨小梁微结构的作用。另有观点认为[12,26]，ASD在可以促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化，该生物学效应的发挥可能与MAPK途径的p38 MAPK和细胞外信号调节激酶(ERK)蛋白存在密切的联系。

2.2 ASD对成骨细胞成骨的影响及相关信号通路研究

ASD可推动成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)和原代成骨细胞的生化进展过程，包括繁殖、分化等，ASD可以提升成骨细胞ALP的生物学活性，促进骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的合成，同时激活p38 MAPK和ERK1/2进而推动骨形成[27-28]。张云辉等[27]研究认为ASD可以推动骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，这进一步揭示ASD对于成骨细胞的影响，主要通过影响骨髓间充质干细胞的繁殖、分化。经过笔者对大量ASD对成骨细胞影响的文献研究发现[9, 23-24, 27]，现有研究认为ASD对成骨细胞的影响，主要是通过调控BMSCs的发生、发展间接促进成骨，进而产生抗OP的作用。

BMP-2与BMP受体两者相结合，可诱导形成异源复合物受体，进一步推动MAPK信号通路中ERK1/2蛋白的磷酸化[29]。ERK1/2蛋白的激活可以逆向促进BMP-2蛋白的表达，从而促进成骨细胞的分化和成熟，因此在促进成骨细胞的分化与成熟过程中，MAPK信号通路发挥着至关重要的作用[9,27]。有研究发现[23]，ASD可以促进β-catenin、Runx2以及OCN基因的表达，而通过使用Wnt信号阻断剂对BMSCs进行预先处理后，可以降低ASD诱导的成骨基因表达，这从侧面印证了ASD可通过W nt/β-catenin信号通路促成骨分化。有研究[25]将JNK信号通路阻断后，ASD诱导成骨分化的生物学过程受到抑制，因此JNK信号通路的激活可能是ASD促进成骨细胞分化的其中一种分子机制。Ke等[11]研究认为，ASD具有促进卵母细胞增殖、成骨分化和矿化的作用，ASD可以促进BMP-2表达和p38 MAPK和ERK1/2活化，证实其在促进成骨细胞分化中的作用依赖于BMP-2等[30]，Runx2的表达增加依赖于PI3K/AKT信号通路。BMP-2能够促进成骨基因RUNX2的表达，Runx2能够通过增加PI3K、AKT的蛋白水平来提高PI3K/AKT信号通路的活性。此外，PI3K/Akt信号增强了Runx2和 Runx2依赖转录的DNA结合，这种正反馈回路进一步增强了成骨细胞分化过程中Runx2的活性[31]，因此ASD的成骨分化可能与PI3K/AKT信号通路密切相关。

3 ASD对破骨细胞活性影响的研究

OP的发病机制主要与骨形成及骨吸收两者的代谢失衡密切相关，破骨细胞(osteoclast，OC)的生物学活动在OP的发生发展过程中发挥着重要的作用。现已发表的中外文献中，阐述ASD在破骨细胞层面发挥生物学作用的研究尚少，主要集中在口腔医学领域，涉及ASD在生物学通路调控破骨细胞治疗OP或骨代谢相关疾病的研究尚缺。现关于ASD与破骨细胞的研究，主要是通过牙科领域动物实验模型证实了ASD可以增强牙周破骨细胞的活性，促进牙槽吸收及重建。陈佩佩等[32-33]研究ASD对大鼠正畸牙周组织改建的影响中发现，局部注射ASD可明显促进压力侧牙周组织破骨细胞的活性，促进破骨细胞的形成，进而推动牙周改建的进程并加速正畸牙移动。亦有研究结果认为[34]，ASD通过使血液循环代谢加快，间接推动破骨细胞功能活跃，而破骨细胞诱导的压力侧促进牙槽骨吸收，并且认为成骨细胞发挥着重要的调控作用，而在在张力侧会促进新骨生成，新骨的生成也需要成骨细胞干预，而ASD对牙周成骨细胞的作用仍需进一步探讨。鉴于目前阐述ASD与破骨细胞之间关系的研究有限，ASD是否能够对牙周组织以外的破骨细胞产生生物学及药理学上的干预，促进相关破骨细胞的凋亡或提升其活跃性，从而调整破骨细胞与成骨细胞的动态平衡，进而起到防治骨质疏松的作用，尚需大量的基础实验及临床试验进行发掘、研究及验证。

4 小结

目前临床上使用的骨质疏松药物大部分为骨吸收抑制剂(如雌激素、降钙素等)，而骨形成相关药物不足，药物的临床疗效主要是改善症状、延缓病情进展，仍然未能逆转病情甚至治愈[35]，且大部分抗骨质疏松药均存在一定的不良反应[36]。大量的实验及临床研究表明[10, 37]，续断具有促进骨形成、防治OP的药理功效。ASD具有通过多种生物学通路促进BMSCs向成骨细胞分化的潜在功效，从而起到防治OP的作用[23-25]。

ASD可以从多个细胞层次及不同的生物学信号通路调节骨代谢，从而起到抗骨质疏松的功用，主要表现在以下几个方面：ASD可以促进BMSCs向成骨细胞方向进行繁殖、分化，可能是通过JNK、Wnt、p38 MAPK等信号通路促进BMSCs分化，促进骨形成，从而防治骨质疏松；ASD可以通过多条生物学信号通路影响成骨细胞的繁殖及分化，其中可能与ASD调节骨细胞ALP、BMP-2、Runx2等细胞因子或蛋白成分，激活MAPK、β-catenin、PI3K/AKT等信号通路，进而促进骨形成，起到抗OP的作用(如图1)。此外，本综述发现目前阐述ASD与破骨细胞之间关系的研究十分有限，ASD是否能够对牙周组织以外的破骨细胞有所抑制，从而调整破骨细胞与成骨细胞的动态平衡，进而起到防治骨质疏松的作用，或是ASD对于破骨细胞在人体不同部位的骨骼组织、骨代谢有着双向调节作用，可抑制破骨细胞活性，亦可增强破骨细胞活动，尚需大量的基础实验及临床试验进行发掘、研究及验证。

图1 ASD抗骨质疏松的机制关系图Fig.1 The mechanism of ASD against osteoporosis

综上所述，ASD能够在多个细胞层面以及通过多种信号通路对成骨细胞进行干预，起到增加骨骼密度，改善骨小梁微观结构的效用，并能有效地防治骨质疏松及其继发性疾病。许多国内外实验及临床研究结果表明，ASD在治疗OP方面具有巨大的药理学潜力及临床应用价值，但目前以ASD单体成分研发的抗骨质疏松药物尚无，部分药理学作用机理仍不清楚，如ASD通过干预破骨细胞能否抗骨质疏松，因此ASD是否能进一步推广应用于临床，尚需要大量的基础动物实验、多中心临床试验提供有力的循证依据，以进一步明确ASD作用的生物学通路、作用靶点。