基于网络药理学探讨二仙汤治疗骨质疏松症作用机制

史佩玉 高帅 綦向军 莫嘉浩 张唤唤 朱俊霞 陈国铭 林樫 方彩珊 徐福平

1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 5104052.广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 5104053.广州中医药大学第二附属医院，广东省中医院治未病中心，广东 广州 510120

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种常见的骨骼疾病，主要以骨量降低、骨组织微结构损坏，进而导致骨脆性增加，容易发生骨折为特征的全身性骨骼疾病[1]。骨质疏松症在祖国医学中属于“痿”“骨痹”“骨枯”的范畴，主要的病机为肾精亏虚，髓海空虚，骨失濡养，是一种全身骨骼的慢性退行性疾病[2]。典型的临床表现为脊柱变形、疼痛、发生脆性骨折。骨质疏松症是一种年龄相关性疾病，随着当今社会医疗条件的提高，人口老龄化的加剧，骨质疏松症逐渐成为一个社会所公认的严峻问题，严重影响了老年人的生活质量[3-5]。据统计，2016年中国60岁以上的老年人骨质疏松患病率为36%，其中男性为23%，女性为49%[6]。目前，抗骨质疏松症的药物按照其作用机制主要有骨吸收抑制剂、骨形成促成剂和其他机制类药物[7]，但这些药物只能缓解患者的临床症状，并不能从根本上改善骨代谢的情况，也不能调节成骨和破骨过程的动态平衡，长期使用会存在一定的副作用，同时对于有某些基础病患者临床的使用也有一定的限制[8]。目前，中医药治疗骨质疏松症的疗效逐渐被患者所认可，引起了当今国内外学者的关注[9-10]。

二仙汤是张伯纳教授于20世纪50年代研制出的名方，以温补肾阳，补益肾精，泻相火，调理冲任为主要功效，全方由仙茅、仙灵脾(淫羊藿)、巴戟天、当归、黄柏、知母六味中药组成，温而不燥，寒而不滞，具有调和阴阳之效[11]，对于骨质疏松症有良好的防治作用[12-14]。实验研究发现，二仙汤可以通过多种途径作用于人体，明显改善骨质疏松症，可能的机制之一是调节相关信号转导通路蛋白，影响成骨细胞或破骨细胞的增殖分化，提高血钙水平，促进骨形成的同时抑制骨吸收以此来维持骨量[15-17]。也可以通过下调生物氧化相关蛋白来发挥抗氧化的作用，调节细胞骨架蛋白，保护细胞，从而预防骨质疏松症[18]。但是，二仙汤治疗骨质疏松症有效成分繁杂，涉及靶点通路众多，起效机制复杂，传统药理学难以进行系统的分析。随着系统生物学的新兴和发展，网络药理学作为研究药物作用机制的新方法，从整体的角度探索药物与疾病之间的关系，系统综合地分析药物对疾病网络的干预与影响，从而揭示药物系统作用于人体的机制，与中医学整体观念、辨证论治的思想相契合，同时与中药方剂多途径、多靶点的治疗原理一致[19-20]。本文拟运用网络药理学技术探究二仙汤治疗骨质疏松症的作用机制，为骨质疏松症的治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 二仙汤活性成分与作用靶标预测

以“仙茅”“淫羊藿”“巴戟天”“当归”“黄柏”“知母”6味中药作为Herb name在中药系统药理学分析平台(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中检索二仙汤活性成分，并通过设置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(druglikeness，DL)≥0.18[21]来进行活性成分的筛选。OB是指药物进入循环系统的程度和速度，是客观评价药物内在质量的重要指标，活性成分的OB值越高代表其用于临床的可能性就越大；DL常用于分析药物活性结果、预测体内药代动力学、评价药物分子成药性的优劣程度[22]。运用TCMSP数据库查找筛选所得活性成分对应的作用靶标信息，并将作用靶标信息输入到Uniprot(https://www.uniprot.org)中获取其对应的标准基因名。

1.2 骨质疏松症基因检索

通过TTD(https://db.idrblab.org)、Genecards(https://www.genecards.org)、OMIM(https://www.omim.org)、DisGeNET(http://www.disgenet.org)在线数据库，设置关键词为“Osteoporosis”进行骨质疏松症基因检索，将4个在线数据库中获得的基因汇总后去重，即得到骨质疏松症基因。

1.3 构建“二仙汤药物-活性成分-交集靶标基因”网络图

获得二仙汤作用靶标与骨质疏松症基因后，取两者的交集靶标基因，与二仙汤活性成分、药物一一对应，并采用Cytoscape3.7.0软件(http：//cytoscape.org/)构建“二仙汤药物-活性成分-交集靶标基因”网络图。

1.4 二仙汤-骨质疏松症交集靶标基因PPI网络构建与关键基因的筛选

将二仙汤-骨质疏松症交集靶标基因输入到STRING数据库(https://string-db.org/)，物种设置为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设为最高置信度“highest confidence(0.900)”，并隐藏PPI网络中无关联的靶标基因，得到PPI网络信息，再运用Cytoscape3.7.0软件将PPI网络可视化处理。关键基因是基于蛋白质相互作用网络得到的，在相关通路中具有调控其他基因作用的重要基因[23]。由于使用Cytoscape3.7.0软件构建蛋白(基因)相互作用网络后，较多的蛋白/基因节点-节点间的连线常常会掩盖住关键基因，本研究拟运用CytoHubba插件中的MCC、Closeness、EcCentricity、Degree、Stress等算法进行网络分析寻找关键基因[24]。MCC算法在预测基因方面发挥着重要的作用，具有更大的优势[23]，故本研究采用CytoHubba插件中的MCC算法，筛选二仙汤治疗骨质疏松症的关键基因，MCC数值越高，代表节点在网络中越重要。

1.5 GO分析和KEGG通路富集分析

将筛选出的二仙汤治疗骨质疏松症的关键基因导入到g:Profiler网站(http://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)进行GO分析和KEGG通路富集分析。根据富集基因数进行排序，选取排名在前20的生物途径(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)和骨质疏松症相关信号通路，使用Omicshare工具(http://www.omicshare.com/tools/)绘制高级气泡图。最后运用R软件绘制靶标-通路机制干预图。

2 结果

2.1 二仙汤活性成分与作用靶标预测结果

在TCMSP数据库中，以OB≥30%和DL≥0.18作为筛选条件，共筛选得到二仙汤活性成分104种，其中仙茅包括环木菠萝烯酸(cycloartenol)、仙茅皂甙C(curculigosaponin C)等7种；淫羊藿包括乙酸亚油醇酯(linoleyl acetate)、淫羊藿苷(Icariln)等23种；巴戟天包括槲皮素(quercetin)、茜草素-2-甲醚(alizarin-2-methylether)等20种；当归包括β-谷甾醇 (beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)等2种；黄柏包括小檗碱(berberine)、广玉兰内酯(magnograndiolide)等37种；知母包括山柰酚(kaempferol)、薯蓣皂甙元(diosgenin)等15种。通过TCMSP数据库和Uniprot共预测得到二仙汤靶标基因224个(部分活性成分没有作用靶标)。

2.2 “二仙汤药物-活性成分-交集靶标基因”网络图的构建

在TTD、Genecards、OMIM、DisGeNET在线数据库中检索骨质疏松症基因，去重后取并集共获得骨质疏松症基因3 633个，与二仙汤靶标基因交集映射，共得到二仙汤治疗骨质疏松症交集靶标基因145个。“二仙汤靶标基因-骨质疏松症基因”韦恩图见图1。构建“二仙汤药物-活性成分-交集靶标基因”网络图，详见图2。该网络由217个节点和1 656条边组成，粉红色圆形节点代表交集靶标基因，浅绿色八边形节点代表二仙汤活性成分，青色菱形节点代表二仙汤药物。根据网络拓扑学分析结果，槲皮素、山柰酚、淫羊藿苷等活性成分显著性较高，在网络中起重要作用。由图2可知，一种活性成分可作用于多个交集靶标基因，一个交集靶标基因也可由多种活性成分所拥有，各活性成分与交集靶标基因间相互作用联系，体现了二仙汤治疗骨质疏松症涉及多成分、多靶点的特点。

图2 “二仙汤药物-活性成分-交集靶标基因”网络图Fig.2 Network of “Erxian decoction-active ingredient-intersecting target genes”

2.3 PPI网络构建与关键基因筛选结果

根据CytoHubba插件中的MCC算法筛选出JUN、TNF、RELA等排名在前50的关键基因，详见表1。构建二仙汤-骨质疏松症交集靶标基因PPI网络图，详见图3。该网络由132个节点和582条边组成(由于在STRING数据库中设置隐藏无关联的节点，故有13个交集靶标基因未参与网络构建)，图3中50个八边形节点代表关键基因，82个菱形节点代表非关键基因，节点颜色由浅黄到深红说明其MCC数值越高，在网络中的作用越显著。

图3 “二仙汤-骨质疏松症交集靶标基因PPI”网络图Fig.3 PPI network of “Erxian decoction-OP intersecting target genes”

表1 关键基因信息Table 1 Information of the key genes

2.4 关键基因GO分析结果

GO分析结果显示，二仙汤-骨质疏松症关键基因参与的生物途径主要包括信号转导(signal transduction)、生物过程的阳性调节(positive regulation of biological process)等；关键基因主要调控的细胞组分为胞内细胞器腔(intracellular organelle lumen)、核浆(nucleoplasm)等；分子功能主要包括酶结合(enzyme binding)、信号受体结合(signaling receptor binding)等，详见图4～6。

图4 关键基因生物途径图Fig.4 Biological process of the intersecting target genes

图5 关键基因细胞组分图Fig.5 Cell components of the intersecting target genes

图6 关键基因分子功能图Fig.6 Molecular function of the intersecting target genes

2.5 关键基因KEGG通路富集结果

如图7所示，二仙汤治疗骨质疏松症关键基因主要涉及PI3K-Akt信号通路、NF-kappa B信号通路、TNF信号通路、Wnt信号通路、雌激素信号通路等。运用R软件对PI3K-Akt信号通路和TNF信号通路进行靶标-通路分析，图中红色标记代表二仙汤可能干预的潜在作用靶标，详见图8、图9。

图7 关键基因KEGG通路富集图Fig.7 KEGG pathways of the intersecting target genes

图9 TNF信号通路机制图Fig.9 Machine drawing of TNF signaling pathway

3 讨论

二仙汤由仙茅、仙灵脾(淫羊藿)、巴戟天、当归、黄柏、知母等六味中药组成，其在提高骨密度，改善缓解疼痛，以及防治骨质疏松症方面有独特的优势[25]。二仙汤中所含活性成分主要包括淫羊藿苷、槲皮素、山柰酚等黄酮类化合物。淫羊藿苷是淫羊藿用于治疗骨质疏松症的主要活性成分，具有促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞骨吸收的双重作用，在预防骨量丢失方面发挥着重要作用[26]。相关研究表明，淫羊藿苷可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化，增加钙盐的沉积，促进骨的生成[27]；同时，淫羊藿苷能够调控OPG/RANKL/RANK系统，抑制核因子κB受体激活因子配体(receptor activator for NF-κBligand，RANKL)与破骨细胞标志物核因子κB受体激活因子(nuclear factor kappa-B，RANK)的结合，上调OPG/RANKL的比值，减少破骨细胞的生成与活化[28]。王艳[29]通过动物实验发现槲皮素亦能够上调骨组织中OPG的表达，下调RANKL的表达，降低破骨细胞的生成，减少骨吸收。上述二仙汤中两种重要的活性成分发挥防治骨质疏松症的作用机制均与OPG/RANKL/RANK系统相关，这与近年来的研究一致[30-31]。山柰酚可以起到雌激素类作用，显著增加绝经后骨质疏松症患者骨密度，提高骨矿物质含量，改善骨微结构，缓解骨质疏松症状[32]。

由图2“二仙汤药物-活性成分-交集靶标基因”网络及PPI网络分析结果可知，二仙汤各药物中所含活性成分可以作用于多个靶标基因，并且JUN、TNF-α、IL6、AR等多个靶标基因也与多个二仙汤活性成分有相互作用，表明二仙汤各活性成分与靶标基因之间存在着协同作用。JUN基因是快速反应基因，可对外界刺激做出迅速反应，为JAK-STAT信号通路上的重要转录因子，可以调控成骨细胞相关基因的表达，促进成骨细胞的增殖与分化[33]。TNF-α为炎症发生早期出现的重要炎症因子，通过激活NF-κB促进RANKL诱导的破骨细胞形成，增强破骨细胞骨吸收，为骨质疏松症的上调基因[34]。因此，笔者推测通过下调骨质疏松症患者体内TNF-α水平，可以下调RANKL的表达，减少破骨细胞的生成，起到防治骨质疏松症的目的。IL6为重要的炎症因子，赵旭等[35]发现通过早期下调IL6水平，可以抑制破骨细胞活化，减少骨吸收。雄激素在男性骨骼生长与骨量保持中发挥重要作用，雄激素水平降低会导致骨量减少，骨密度下降，诱发骨质疏松症[36]。AR为雄激素受体，与雄激素结合后进入细胞核，直接调控靶基因的表达，并具有调控成骨细胞与破骨细胞的功能，其调控骨代谢涉及多条信号通路：一方面可以调控经典wnt信号通路等，促进骨的生成；另一方面又可以调控RANKL/OPG信号通路等，抑制骨的吸收[37]。上述二仙汤治疗骨质疏松症的关键基因调控成骨细胞与破骨细胞涉及信号转导、细胞的增殖与分化、信号受体结合等多种生物途径和分子功能，与本研究GO富集结果相一致。

KEGG信号通路富集结果显示PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、NF-kB信号通路、TNF信号通路、Wnt信号通路、雌激素信号通路富集较多关键基因，可能是二仙汤治疗骨质疏松症的关键信号通路。碱性磷酸酶(ALP)是早期成骨细胞分化的重要标志，活化PI3K-Akt信号通路可以增强ALP的活性，刺激成骨细胞的增殖与分化，抑制成骨细胞的凋亡[38-39]。MAPK信号通路的下游信号通路包括ERK通路、JNK通路、P38通路等，其中ERK通路可维护骨代谢平衡，JNK通路影响骨的形成，P38通路促进成骨细胞生成并可抑制破骨细胞分化[40]。PI3K-Akt信号通路与MAPK信号通路间关系密切，具有协同作用，共同调控成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化及凋亡[41]。破骨细胞的激活依赖于核因子kB受体激活因子配体RANKL与RANK的结合，进而活化NF-kB信号通路，促进破骨细胞的分化[42]，通过下调NF-kB信号通路，能够抑制破骨细胞分化，是二仙汤治疗骨质疏松症的重要信号通路。RANK是RANKL的唯一受体，为TNF受体家族中的一员，TNF-α可以增加RANKL的表达，诱发破骨细胞分化[34， 42]。由此可见，OPG/RANKL/RANK系统调控成骨细胞和破骨细胞与NF-kB信号通路、TNF信号通路密切相关，也印证了二仙汤治疗骨质疏松症的信号通路间相互联系，起协同作用。经典的Wnt信号通路可以直接作用于Runx2促进骨的形成，亦可以通过增强ALP的活性间接起到成骨作用[43-44]，非经典的Wnt信号通路具有促进成骨和抑制成骨的双向调节作用[45]。雌激素可以汇聚Wnt信号通路、蛋白激酶通路、BMP-2信号通路等共同调控成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化和凋亡[46]。相关研究表明，Toll样受体信号通路[47]、HIF-1信号通路[48]、JAK-STAT信号通路[49]等亦可以直接或间接调节骨代谢而起到治疗骨质疏松症的作用。

本研究基于网络药理学方法探讨二仙汤治疗骨质疏松症作用机制，发现二仙汤中的淫羊藿苷、槲皮素、山柰酚等活性成分可能通过JUN、TNF-α、IL6、AR等多个关键基因富集于PI3K-Akt、MAPK、NF-kB、TNF、Wnt、雌激素等信号通路，起到调节骨代谢，促进成骨细胞生成和抑制破骨细胞分化，治疗骨质疏松症的目的。但在实际运用中，二仙汤各中药在煎煮过程中活性成分可能会发生改变，目前虽无相关文献对此进行研究，但亦不容忽略，有待进一步研究。