重组结核分枝杆菌感染鉴别用变态反应原研究与应用

徐苗 王国治

自1890年科赫发明用于结核病免疫治疗的结核菌素(tuberculin)，1907年奥地利人V.Pirquet将结核菌素作为结核病诊断试剂以来[1]，产品也从滤液蛋白粗提物改进为结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)，在结核菌素用于结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST )逾百年后的今天，该类产品依然在结核病辅助诊断、流行病学调查，以及卡介苗接种阳转考核中发挥着巨大作用。随着结核病疫情的变化，早在2002年我国研究者已经发现 “靠单纯DOTS的现代结核病控制策略，无法解决已经感染结核分枝杆菌人群发展为结核病的潜在威胁，积极发现和治疗结核病与对已感染结核分枝杆菌的高危人群实施预防是结核病控制的根本”[2]。而我国是结核高感染率与卡介苗高接种率的国家，TST对结核病患者、结核感染者及卡介苗接种者均呈阳性，难以鉴别卡介苗接种与结核感染，检测结果特异性欠佳。因此，选择能有效区分卡介苗与结核分枝杆菌的抗原，研制新一代结核分枝杆菌变态反应原，用于筛查潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)者成为研究热点。我国研究者从单一结核分枝杆菌早期分泌性靶抗原6(ESAT-6)起步研究[3]，经过近20年的努力，成功研制出结核分枝杆菌重组ESAT-6与培养滤液蛋白10(CFP-10)融合蛋白变态反应原[4]。该产品2020年由安徽智飞龙科马生物制药有限责任公司上市，并由国家药典委员会确定中文通用名称为“重组结核杆菌融合蛋白(EC)”(简称“EC”)，为实现LTBI人群的筛选与预防提供了技术支撑。

EC-皮肤试验(EC-ST)用于LTBI检测方法的建立

据WHO估计，目前全世界有1/3人口为LTBI者。通常情况下，90%的LTBI者终身保持健康，但其余10%的LTBI者最终会发展成活动性结核病[5-6]。因此，LTBI的筛选与预防，是终结结核病的重点。WHO对LTBI定义为：“一种由结核分枝杆菌抗原刺激导致的持续免疫状态，但没有活动性结核病的证据”，同时认为“检测LTBI没有金标准”[7]。鉴于LTBI无明确的临床证据，WHO推荐的两种检测方法中，TST与γ-干扰素释放试验(interferon-γ release assays，IGRA)检测结果差异存在统计学意义；即便是IGRA，不同类型试剂、同一类型不同厂家的试剂检测结果也不完全一致。因此，对新型EC的诊断效果如何评价，便是一个实际困难。研究者充分考虑国内结核感染情况、卡介苗接种情况及现有的对照试剂，主要基于对EC、与其有相同用途的IGRA，以及TST在不同人群中检测结果的比较，并且对不同方法阳性检出率和结核分枝杆菌不同感染程度的关联性进行分析，对EC开展临床评价。

一、EC作为LTBI检测试剂的可行性评估

依据EC、IGRA与TST检测的基本原理，在临床评价中提出以下总体评价思路与评价指标：(1)EC 为结核特异性抗原，理论上EC-ST对确诊的结核病患者应呈阳性反应，对卡介苗接种者应呈阴性反应。基于该原理，临床研究中如EC-ST在结核病患者中的阳性反应率、在卡介苗接种者中的阴性反应率符合理论预期，则提示健康人群中EC-ST皮肤试验阳性者为LTBI者的概率高。(2)由于EC-ST与IGRA检测均利用卡介苗中丢失相关蛋白的原理，理论上EC-ST和IGRA在结核病患者或卡介苗接种者的阳性检出率差异应无统计学意义。 (3)由于EC-ST与TST所用抗原不同，理论上结核病患者EC-ST和TST应均为阳性，二者阳性率差异应无统计学意义；而卡介苗接种者中，TST应为阳性，EC-ST应为阴性，二者阳性率差异应有统计学意义。

临床研究结果表明：EC-ST对确诊结核病患者皮肤试验阳性检出率为90.64%，对卡介苗接种者阳性检出率为7.28%，与预期假设相符；在结核病患者与卡介苗接种者中IGRA阳性检出率分别为91.15%与4.75%，与EC-ST检测结果比较，差异无统计学意义；提示EC-ST临床使用效果与IGRA一致性较好。考虑到EC-ST价格低、操作简便，较IGRA更适合用于LTBI者的筛查。结核病患者中TST阳性率为90.90%，与EC-ST比较差异无统计学意义；但在卡介苗接种者中皮肤试验的阳性率高达73.42%，与EC-ST比较差异有统计学意义，提示EC-ST可有效鉴别卡介苗接种与结核感染[8]。

二、不同人群结核感染程度与EC阳性检出率的关联性验证

EC试剂应用的适应证之一为结核感染筛查。本产品的Ⅲ期临床试验研究中统计出结核病患者、非结核呼吸道疾病患者、健康人群、卡介苗接种人群等不同人群的EC-ST阳性率；并根据免疫学检测阳性检出率的高低，将受试人群分成高、中、低三种不同等级[9]；通过对不同人群的EC-ST阳性检出率进行汇总分析，探讨EC-ST阳性检出率与受试者结核感染程度的关联性，相关结果如下。

(一)结核免疫学检测高阳性率人群

此类人群包括病原学检测或临床诊断为结核病患者，其EC-ST应有高阳性检出率；在临床上与结核病有类似症状，不能完全排除结核病的疑似患者，其EC-ST阳性率可能低于结核病患者，但高于健康人群。

1.菌阳肺结核患者：通过病理学检查或病原体分离培养确诊的结核病患者，此类人群结核感染可能性最大，其结核免疫学检测的阳性检出率应最高。

2.菌阴肺结核患者：缺少病理学和病原学诊断依据的肺结核患者，易与其他疾病混淆，也可能为非结核分枝杆菌感染；此类人群结核感染可能性较大，其结核免疫学阳性检出率较高，但低于菌阳肺结核患者。

3.非结核呼吸道疾病患者：指临床上有呼吸道症状，诊断为非结核病，但极易与结核病患者相混淆；此类人群可能包括结核病未检出，或非结核呼吸道疾病患者，其结核免疫学阳性检出率应低于菌阴肺结核患者。

(二)结核免疫学检测中阳性率人群

此类人群包括已感染结核分枝杆菌但未发病、已感染结核分枝杆菌但未检出、结核病患者的密切接触者、结核病高发或低发地区的健康人群；此类人群具有一定程度的结核感染风险，其结核免疫学阳性检出率理论上应相对低于结核病患者或非结核呼吸道疾病患者。

(三)结核免疫学检测低阳性率人群

本项目中将结核感染低风险人群定位为：经结核感染T淋巴细胞斑点试验(T-SPOT.TB，IGRA中的一种技术方法)、TST(TB-PPD皮肤试验)、EC-ST等3种免疫学检测结果均为阴性(简称“三阴性人群”)，且接种卡介苗或安慰剂的人群。理论上，三阴性人群接种安慰剂后，3种检测方法依然均为阴性；三阴性人群接种卡介苗后，EC-ST和T-SPOT.TB检测结果应为阴性，TST作为卡介苗接种后阳转考核方法，检测结果则为阳性。

上面3种情况是理论分析的预期皮肤试验结果，在实际临床试验中，不同人群的3种免疫学检测结果见图1。EC-ST与T-SPOT.TB检测阳性率随结核感染风险提高而增加，TST除卡介苗接种者阳性率高于EC-ST和T-SPOT.TB外，其余结果变化规律与EC-ST和T-SPOT.TB结果相似[8]。上述结果提示EC-ST的阳性检出率的确与结核感染程度密切相关，符合临床研究前对不同人群皮肤试验反应结果的预期。

图1 EC-ST、TST和T-SPOT.TB在不同人群中的阳性检出率

EC与PPD诱导的皮肤变态反应异同分析

PPD系由结核分枝杆菌培养滤液中提取的蛋白，可诱导特异性迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity，DTH)；该蛋白含有致病性分枝杆菌、环境中分枝杆菌及卡介菌的共有抗原，故TST不能明确区分卡介苗免疫、外界分枝杆菌感染和结核分枝杆菌感染,对卡介苗接种或者曾经感染但体内未有存活结核分枝杆菌者依然呈阳性反应，TST阳性只能代表其曾经感染分枝杆菌，无法真正判断其是否发病或处于LTBI状态。因此，寻找能区别卡介苗接种还是结核分枝杆菌感染、结核分枝杆菌感染者体内是否还存在活菌的诊断制品有着非常重要的价值。结核分枝杆菌差异区域1(region of difference-1，RD-1)的蛋白抗原,可诱发结核分枝杆菌致敏的豚鼠发生DTH，其中最具代表性的是ESAT-6和CFP-10蛋白。卡介菌在减毒及传代过程中丢失了编码这些蛋白的基因,而且非结核分枝杆菌中该基因只在少数分枝杆菌如堪萨斯、海、微黄和苏加等分枝杆菌中存在。作为皮肤试验变态反应原，重组EC蛋白检测的特异性较强,且具有较强的细胞免疫活性。中国食品药品检定研究院以结核分枝杆菌死菌、活菌和卡介苗分别致敏豚鼠，用PPD和重组EC蛋白对致敏豚鼠进行皮肤试验，观察其局部反应。结果显示：重组EC蛋白仅与结核分枝杆菌(活菌)致敏豚鼠呈阳性反应，对卡介苗致敏豚鼠和灭活结核分枝杆菌致敏豚鼠呈阴性反应；而PPD对上述3种致敏豚鼠均呈阳性反应。该结果直观表明重组EC蛋白与卡介苗感染无交叉反应，有可能用于卡介苗接种与结核感染的鉴别[4，10]。

PPD与重组EC蛋白皮肤试验均可诱导DTH，其作用机理类似，即已致敏个体的淋巴细胞与结核变态反应原(重组EC蛋白)发生特异性结合，引发单核细胞浸润为主的免疫反应，释放趋化因子，使大量多核细胞和淋巴细胞渗出；渗出的致敏淋巴细胞合成并释放游走抑制因子、白细胞介素(IL)-2、γ-干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子，免疫细胞由于游走抑制及其他细胞因子的作用而停止移动并聚集，发育增殖，形成更多的免疫细胞聚集，使皮肤反应呈现出迟发变态反应性炎症，注射局部出现红肿、硬结。尽管PPD与重组EC蛋白两种变态反应原的作用机理类似，但二者抗原性与免疫原性不同，诱导产生的局部皮肤变态反应也不尽相同；PPD诱导的DTH其硬结的厚度相对较重组EC蛋白诱导的更厚，而重组EC蛋白诱导的DTH其硬结虽然小且薄，但其诱导产生炎性红晕反应明显大于PPD，阳性反应的高峰时间也与PPD不完全一样[10]。

一、EC-ST诱导局部DTH反应的判断标准

虽然EC-ST诱导的DTH反应所产生的红晕或硬结均为特异性反应，但在临床研究中发现，肺结核患者中以硬结为判断标准时，其阳性率低于以红晕为判断标准的阳性率；在卡介苗或安慰剂接种者中，以红晕与硬结两种判断标准的阴性率接近。据此可知，以红晕为判断标准可提高敏感度，且不产生非特异性反应，故可以红晕为EC-ST的判断标准。同时考虑到肤色较深的人群中可能红晕不易鉴别，且临床研究中发现部分受试者硬结反应大于红晕反应，因此在EC-ST判断标准界定为“以红晕或硬结大者为准，其反应平均直径(横径与纵径之和除以2)不低于5 mm 为阳性反应。”

二、EC-ST和TST的判读时间

传统TST诱导的DTH是以皮肤试验后48～72 h的硬结平均直径作为判定标准，而EC-ST红晕或硬结的平均直径均可作为阳性判定标准。临床研究结果提示，EC-ST皮肤试验后24～72 h内均可进行结果判读，用作结核病辅助诊断或LTBI筛查时，EC-ST的观察时间可提前至皮肤试验后24～48 h；如果要进行疫苗接种人群筛查，需要与PPD同体双臂进行皮肤试验，由于目前PPD观察时间为注射后48～72 h,可取EC-ST与TST后48 h作为共同观察时间。

三、EC-ST与TST对感染早期的应答

不同免疫学诊断方法对感染后免疫反应的应答时间不同， EC-ST与TST由于其抗原不同，引起的免疫学阳性时间也有所不同。无论是流行病学研究还是临床辅助诊断，能越早检测出阳性反应的试剂则性能越优。研究者以活的结核分枝杆菌致敏豚鼠模型，评价了EC-ST与TST对感染动物的早期免疫应答[11-12]。研究结果表明，动物采用活菌感染后第10天EC-ST有1/3动物阳转，第12天阳转率达100%；而动物感染后第14天TST仅有1/8动物阳转，第28天则所有动物都阳转。该结果提示EC-ST早期应答能力优于传统TST，但该结果还需做进一步人体流行病学研究予以证实。

四、EC-ST与TST引起的复强反应

结核菌素类皮肤试验制品蛋白相对的免疫原性较低，PPD与重组EC蛋白豚鼠致敏效应研究结果都表明，即使以高浓度样品3次以上致敏动物后，以同品种变态反应原进行皮肤试验，也无法诱导动物产生DTH。但在临床实践中，皮肤试验阴性人群在3个月后再次做皮肤试验，部分人群可能表现为阳性。这在结核病聚集性暴发疫情需进行二次皮肤试验时，可能影响结果的可靠性。中华人民共和国国家卫生与计划生育委员会在《学校结核病防控工作规范(2017版)》[13]中明确规定：“对密切接触者中初次筛查TST非强阳性者，应当在2～3个月后再进行TST筛查，以便早期发现初次筛查时仍处于窗口期的新近感染者”。在重组EC蛋白的临床评价研究中，健康受试者经EC-ST、T-SPOT.TB、TST等3种方法筛选均为阴性反应者作为结核分枝杆菌未感染者，对其接种卡介苗或安慰剂，12周后再进行上述3种方法检测。发现161例安慰剂接种者接种后12周再次进行皮肤试验，EC-ST、T-SPOT.TB、TST在该人群的诊断特异度(阴性符合率)分别为88.20%、93.17%、60.87%[8]。传统TST的复强反应严重程度明显高于重组EC蛋白，该结果提示在结核病聚集性暴发疫情发生需进行流行病学筛查时，EC-ST优于传统TST。

EC的使用

EC皮肤试验可单独用于结核病辅助诊断或LTBI的筛查；也可与PPD联合使用，用于结核疫苗免疫接种人群的筛选与疫苗接种效果的评价，使用方式见表1。

表1 EC单独或联合PPD进行皮肤试验的用途

一、EC单独使用

(一)用于菌阴肺结核辅助诊断与LTBI高危人群的筛查

在结核病诊断技术研究中，多数研究者更关注菌阳结核病患者，更偏重于与病原体相关的核酸检测技术的研发，忽略了绝大多数菌阴结核病患者核酸检测依然阴性，核酸检测技术无法明显提高菌阴结核病患者的检出率。根据中国2000年和2010年全国结核病流行病学抽样调查结果，2010年全国活动性、涂阳和菌阳肺结核患病率与2000年相比均呈下降趋势，其中涂阳肺结核患病率年递降率为9.0%，菌阳肺结核患病率年递降率为5.8%，但活动性肺结核患病率下降率仅为0.2%，年递降率缓慢；活动性肺结核患者中菌阴肺结核患者的比率则由2000年的53.64%上升到74.07%。由此可知，中国结核病患者主要为菌阴患者。对菌阴患者而言， EC为临床辅助诊断提供了新的选择。

此外，依据流行病学调查结果表明，活动性肺结核患者中，未被发现的患者占89.5%，明显高于2000年时新发现患者所占的比率(68.8% )；在未被发现的患者中无症状者2000年为12.1%，2010年则为43.1%，如果不对这些无症状结核病患者或LTBI者实施主动筛查，并采取相应的治疗或预防措施，终结结核病则难以实现。考虑到全民筛查不太现实，应采用合理的筛查方式对结核感染高危人群实施筛查，可包括：(1)与结核病患者关联的高风险者，如结核病患者密切接触者、医护人员、聚集性结核病暴发相关人群。(2)与其他疾病关联的高风险者，如HIV感染者、糖尿病患者、风湿病，以及接受免疫抑制剂治疗者、透析患者、矽肺患者等。(3)特殊人群、特殊环境中的高风险者，如羁押人员、社区中老年人群、结核病高发区人群、流浪者、药物滥用者、外来务工群居人员。(4)国家规定须进行LTBI筛查和预防性治疗的人群，如《学校结核病防控工作规范(2017版)》规定，需加强学校LTBI者的筛查和预防性治疗；中华人民共和国国家卫生健康委员会印发的《中国结核病预防控制工作技术规范(2020版)》提出，推行LTBI者中高危人群开展预防性治疗，特别是HIV感染者及艾滋病患者、病原学阳性肺结核患者5岁及以下儿童密切接触者，以及其他LTBI高危人群。

(二)EC-ST与其他诊断方法的优缺点比较

目前，结核病其他免疫学诊断方法主要有IGRA、血清学检测与TST；IGRA在结核病辅助诊断与LTBI者筛查中具有较高的特异度，但实验步骤多，操作相对复杂、难以标准化，不适合作为大规模人群筛查的工具；且价格昂贵，难以在贫困地区推广应用。结核血清学检测技术由于可能产生假阳性与假阴性，WHO在其政策建议中指出，使用目前市面上商业性血液(血清学)检测手段诊断活动性结核病，常常导致误诊和不当治疗，进而损害公众健康。WHO敦促各国采用WHO推荐的准确的微生物或分子检测方法，禁止使用不准确的和未经批准的血液检测方法。TST是使用历史最悠久的结核病辅助诊断方法，虽然方法简便，但所用试剂(PPD)无法区分卡介苗接种与结核分枝杆菌感染，在中国15岁以上人口中TST的阳性率高达44.5%，以TST作为结核病辅助诊断方法的假阳性率偏高、特异度欠佳。

EC-ST采用传统TST的简便技术，同时兼具IGRA检测的特异度，主要优点见表2。

表2 各类优点在3种潜伏性结核感染人群筛查方法中的比较

二、EC与PPD联合使用

通常传染性疾病的免疫预防主要针对未感染人群，而结核病疫苗的接种对象存在未接种卡介苗或卡介苗接种后阴转人群、卡介苗接种后依然维持阳性人群，以及LTBI三类人群；这三类人群中免疫背景与感染状态不同，采用的疫苗也将不同。结核病免疫预防对象的筛查可采用同体双臂方式以TST和EC-ST检测结果为免疫标识，区分未接种卡介苗或卡介苗接种后阴转人群、卡介苗接种后依然维持阳性人群及LTBI三类人群，分别接种不同类型疫苗(表3)。

表3 EC-ST与TST联合使用结果判读与预防措施

TST与EC-ST检测均阴性者鉴别为未接种卡介苗或接种后阴转人群，可接种卡介苗或初免用结核疫苗；TST阳性和EC-ST阴性者鉴定为接种卡介苗后维持阳性人群，可接种加强免疫用疫苗；TST阳性或阴性和EC-ST阳性者鉴定为LTBI人群，可通过免疫治疗方式预防感染人群发展为结核病。

结 语

结核分枝杆菌重组变态反应原的研究已有20余年，但目前国内外在研的品种并不多，除了我国的EC试剂外，国外主要有丹麦血清学研究所(SSI)研发的混合ESAT-6和CFP-10的C-tb试剂，以及俄罗斯研发的ESAT-6和CFP-10融合蛋白的 Diaskintest试剂。在WHO[14]《2019年全球结核病报告》中首次介绍了上述2种试剂及重组结核分枝杆菌变态反应原皮肤试验检测方法，WHO认为：这种基于皮肤试验对新感染检测方法的出现，可最大限度地实施检测平台的优势，并有提高对LTBI诊治水平的潜力，与传统的TST相比可提高和改善特异度；该方法与IGRA相比，上述2种检测方法具有相似的特异度，可为IGRA测试提供准确、可接受和更便宜的替代方案。

由于不同产品的临床研究方案不同，目前除结核病患者检测数据外，尚不能将国内的EC试剂与C-tb与Diaskintest试剂的研究数据进行直接比较。根据C-tb的Ⅲ期临床研究[15]与Diaskintest研究者在2019年最新发表的结核病患者检测数据[16]， EC试剂检测的敏感度大于93%,优于C-tb的72% 和Diaskintest的68%；可能的原因是EC在重组蛋白构建、人用剂量的选择方面较国外产品更为合理。但EC尚缺少大规模的临床验证，如缺少EC皮肤试验阳性反应与结核病发生发展关联性的研究数据；缺少EC皮肤试验对糖尿病、风湿病患者等特殊人群的研究数据；缺少3岁以下65岁以上大样本人群的安全性评价数据；缺少皮肤试验最佳观察时间及不同肤色对皮肤试验反应结果判读的影响等数据。这些都需要广大医护工作者在今后的临床研究中做出共同努力，以便得到进一步完善。