花生致敏蛋白Ara h 1双抗体夹心ELISA法的建立

王 耀 陈 曦 武汉良 卫 星张国庆 张淑霞 刘胜男

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2. 中国人民解放军联勤保障部队第九八九医院检验科，河南 洛阳 471031；3. 三门峡市检验检疫中心，河南 三门峡 472000；4. 郑州海关技术中心，河南 郑州 450002;5. 三门峡海关，河南 三门峡 472000；)

近年来，食物过敏患病率日趋上升[1-2]，由于目前仍缺乏致敏阈值研究以及过敏症状有效治疗方法研究，食物过敏患者只能通过药物缓解过敏症状，并避免接触致敏食物以保护自身[3]。因此，许多国家已通过制定法规或标准，强制要求在食品标签中标识致敏物质[4]。中国食品安全国家标准审评委员会在2018年底公布的《预包装食品标签通则》(GB 7718)修订草案征求意见稿中也已将致敏物质标示作为预包装食品标签标示的基本内容。花生是八大常见致敏食物之一[5]，也是诸多食品标签标准中要求标示的主要致敏成分。花生含有多种致敏蛋白，其中Ara h 1是主要致敏蛋白之一，能被大部分的过敏患者血清识别[6]。Ara h 1约占花生蛋白总量的12%～16%，也是花生中含量最多的致敏蛋白[7]，其三聚体具有很强的稳定性，胃肠道的消化作用和加热均难以破坏其致敏性[8]。因此，为了更好地保障过敏消费者的食品安全，研究食品中花生致敏物质的灵敏、特异、高效检测方法尤为必要。目前，用于花生致敏物质检测的方法主要包括聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)[9-10]、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[11-12]和质谱法(Mass spectrometry，MS)[13-14]，其中PCR和ELISA是实验室、食品企业及监管机构筛查食品致敏成分最常用的快速定性和定量分析方法[15]。PCR是基于致敏蛋白标志性基因的检测方法，不能直接反映是否含有致敏物质[16]，而ELISA是基于蛋白质的检测方法，可利用抗体针对性的检测致敏蛋白。现有用于花生致敏物质检测的ELISA法常基于多抗建立，而利用多抗进行检测时存在特异性不足的问题[17]。试验拟利用所制备的Ara h 1鼠源单抗提高致敏蛋白捕获特异性，再通过Ara h 1兔源多抗进行夹心检测，建立花生致敏蛋白Ara h 1的双抗体夹心ELISA法并对其检测特性进行鉴定，以期为食品中花生致敏蛋白的快速筛查提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试剂溶液

花生致敏蛋白Ara h 1和Ara h 2：美国INDOOR公司；

大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白4种常见致敏蛋白，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(Tetramethyl benzidine，TMB)：美国Sigma-Aldrich公司；

HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(GaRIgG-HRP)：索莱宝生物科技公司；

其他试剂均为市售分析级；

Ara h 1兔源多抗(Polyclonal antibody，pAb)、Ara h 1 鼠源单抗(Monoclonal antibody，mAb)及超纯水：实验室制备；

ELISA包被液(0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，CBS)、稀释液(0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，PBS)、洗涤液(含0.05% Tween-20的PBS，PBST)、封闭液(含5%脱脂奶的PBST溶液)、显色液(TMB缓冲液)、终止液(2 mol/L H2SO4)等溶液：实验室配置。

1.2 主要仪器

电子天平：BSA224S型，德国Sartorius公司；

酶标仪：Multiskan FC型，美国Thermo Scientific公司；

振荡器：Vortex2型，艾卡(广州)仪器设备有限公司；

控温磁力搅拌器：SZCL-2型，巩义市予华仪器有限责任公司；

恒温培养箱：HPX-9052MBE型，上海博迅实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pAb与mAb的制备 pAb为Ara h 1免疫新西兰白兔，经纯化血清制备，其效价达2.56×105以上；mAb为Ara h 1免疫BLAB/c小鼠，通过细胞融合筛选阳性杂交瘤细胞株，经体外诱生腹水法制备[18]，其效价达5.12×105以上，亲和常数Ka为2.65×108L/mol，亲和力较高且具有良好的特异性。

1.3.2 双抗体夹心ELISA步骤 将Ara h 1 鼠源mAb作为捕获抗体包被酶标板，首先用CBS稀释mAb，100 μL/孔加入酶标板，在4 ℃条件下过夜包被，用PBST洗板4次后拍干，再向酶标板加入封闭液200 μL/孔，在37 ℃条件下封闭1 h，洗板(同上)后备用。

检测时首先将样液100 μL/孔加入酶标板，并设置阴性孔(PBS 100 μL/孔加入)，在37 ℃条件下孵育1 h后洗板；将Ara h 1 兔源pAb作为检测抗体，用封闭液稀释pAb，100 μL/孔加入酶标板，在37 ℃条件下孵育30 min后洗板；用封闭液1∶5 000倍稀释GaRIgG-HRP，100 μL/孔加入酶标板，在37 ℃条件下孵育30 min后洗板；显色液100 μL/孔加入酶标板，室温反应显色10 min；最后加入终止液100 μL/孔终止反应，用酶标仪读取OD450nm值。

1.3.3 捕获抗体和检测抗体工作浓度的优化 采用棋盘法优化抗体工作浓度[19]。将mAb用CBS稀释为1∶5 000，1∶7 500，1∶10 000，1∶12 500的稀释度，每个稀释度100 μL/孔包被酶标板两行；第1行加入100 μL/孔确定浓度的Ara h 1标准溶液，第2行加入100 μL/孔PBS作为阴性对照；孵育、洗板后，将pAb用封闭液稀释为1∶2 000，1∶4 000，1∶6 000，1∶8 000的稀释度，每个稀释度100 μL/孔加入酶标板3列；孵育、洗板后，加入封闭液稀释的GaRIgG-HRP进行孵育，然后显色、终止，并测定OD450 nm值。当所测定的OD450 nm值(P)和阴性对照OD450 nm值(N)的比值(P/N)最大时，其所对应的捕获抗体mAb和检测抗体pAb的稀释度分别作为最优工作浓度。

1.3.4 双抗体夹心ELISA法的特性鉴定

(1) 灵敏度：通过检测限(Limit of detection，LOD)的确定以鉴定方法的灵敏度。用PBS配制不同浓度的Ara h 1 标准溶液，利用优化抗体工作浓度的双抗体夹心ELISA法进行检测。以标准溶液浓度的对数值为横坐标，以各标准溶液检测所得OD450 nm值为纵坐标，绘制双抗体夹心ELISA法的标准曲线。然后将空白样品进行20次重复测定，根据标准曲线回归方程得到对应浓度，计算重复测定结果的平均值(X)和标准差(SD)，以X+3SD作为检测限[20]。

(2) 特异性：通过交叉反应试验鉴定检测方法的特异性[21]。利用双抗体夹心ELISA法分别检测高浓度的其他致敏蛋白(花生致敏蛋白Ara h 2、大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白)。若测定OD450 nm值(P)和阴性对照OD450 nm值(N)的比值P/N<2.1，则说明方法与其他致敏蛋白无交叉反应，特异性良好。

(3) 准确度：通过添加回收试验鉴定方法的准确度[22]。在5%脱脂奶中添加Ara h 1，分别配制成10，100，200 ng/mL添加浓度的样品，每个浓度的添加样品利用双抗体夹心ELISA法重复检测6次，通过计算每个添加浓度样品的平均回收率以及变异系数(CV)以鉴定方法的准确度。

(4) 稳定性：在4 ℃条件下避光密封保存已包被捕获抗体的酶标板，利用双抗体夹心ELISA法分别在保存前和保存的第30，60，90天检测同一浓度Ara h 1标准溶液，通过对比不同保存时间测定同一浓度溶液的P/N值的差异，以鉴定方法的稳定性[23]。

2 结果与分析

2.1 捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度

用PBS配制100 ng/mL的Ara h 1标准溶液，利用已包被不同稀释度mAb的酶标板进行棋盘试验，通过不同稀释度的pAb对Ara h 1标准溶液及阴性对照进行检测，得到不同抗体稀释度下的各孔OD450 nm值。结果如表1 所示，当捕获抗体mAb以1∶10 000的稀释度包被ELISA板，检测抗体pAb以1∶8 000的稀释度作为工作浓度时，计算所得P/N值最大，所以捕获抗体mAb和检测抗体pAb最佳工作浓度分别为1∶10 000和1∶8 000稀释。

表1 捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度的优化

2.2 灵敏度鉴定

配制浓度分别为2，4，8，16，32，64，128，256，512 ng/mL的Ara h 1标准溶液，经双抗体夹心ELISA法检测后，以各标准溶液浓度的对数值为横坐标，以检测所得OD450 nm值为纵坐标，绘制标准曲线如图1所示，标准曲线的线性范围为4～256 ng/mL，线性回归方程为y=1.145 7x-0.587 5，R2=0.991 1。重复测定空白样品20次，将测定所得OD450 nm值代入线性回归方程求得测定浓度，计算平均值(X)+3×标准差(SD)，得到方法检测限为4.16 ng/mL，表明所建立的双抗体夹心ELISA法具有良好的灵敏度。

图1 双抗体夹心ELISA法标准曲线

2.3 特异性鉴定

利用双抗体夹心ELISA法分别检测浓度为500 ng/mL的花生致敏蛋白Ara h 2、大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白和牛血清蛋白。所得测定OD450 nm值(P)和阴性对照OD450 nm值(N)结果如表2所示，P/N值均<2.1，表明双抗体夹心ELISA法与其他常见致敏蛋白无交叉反应。由于方法建立所使用的捕获抗体为特异性良好的鼠源mAb，因此能够对单一致敏蛋白识别捕获，使检测方法显示出良好的特异性。

表2 双抗体夹心ELISA法特异性鉴定结果

2.4 准确度鉴定

将Ara h 1添加至5%脱脂奶中，分别配制成10，100，200 ng/mL 3个添加浓度的样品，通过利用双抗体夹心ELISA法重复检测6次，计算每个添加浓度样品的平均回收率及CV，结果如表3所示，平均回收率为85.9%～94.5%，CV为6.1%～8.7%，表明检测方法具有较高的准确度。

表3 双抗体夹心ELISA法准确度鉴定结果

2.5 稳定性鉴定

将已包被捕获抗体的酶标板在4 ℃条件下避光密封保存，分别在保存的不同时间利用双抗体夹心ELISA法检测100 ng/mL的Ara h 1标准溶液，结果如表4所示，不同保存时间测定所得的P/N值均无明显变化，说明4 ℃ 避光密封保存条件下，酶标板至少可稳定保存90 d，表明方法的稳定性良好。

表4 双抗体夹心ELISA法稳定性鉴定结果

3 结论

试验依据双抗体夹心检测原理，利用Ara h 1 鼠源mAb作为捕获抗体，Ara h 1 兔源pAb作为检测抗体，通过棋盘法优化抗体工作浓度，建立Ara h 1的双抗体夹心ELISA法。通过对方法检测特性进行鉴定，其检测限为4.16 ng/mL，具有较高的灵敏度；交叉反应试验表明与其他致敏蛋白无交叉，特异性强；添加回收试验平均回收率为85.9%～94.5%，具有较高的准确度；且在4 ℃条件下避光密封保存90 d内检测结果稳定；能够对快速灵敏、准确特异的对花生致敏蛋白Ara h 1进行检测。与已有的一些基于多抗研制的商品化ELISA试剂盒相比[24]，试验方法通过mAb提高对于单一致敏蛋白的高亲和力特异性捕获能力，再以pAb作为夹心检测抗体，进一步增强对致敏蛋白的高效识别，在检测特异性和灵敏度上表现出了一定优势。能够用于食品标签中致敏物质标示信息的快速筛查，提升花生过敏患者的饮食安全性。