下调PI3K/Akt信号通路对白血病细胞增殖凋亡的影响

黄翠，刘禄社

(河南省人民医院血液病研究所，河南 郑州 450000)

白血病是一类常见的血液系统的非实体性恶性肿瘤，在14岁以下儿童中，其发病率与死亡率高居不下[1]。根据白血病分化程度、病程长短可以分为急性、慢性白血病，发热、贫血、出血倾向、骨和关节疼痛等为其常见症状，儿童及青少年多为急性白血病，起病急剧；老年及部分青年人多为慢性白血病，病情缓慢、逐渐进展[2]。在过去的20年，对于白血病患儿临床治疗主要以药物化疗、骨髓移植治疗、靶向治疗为主，但由于细胞增殖后的失控、凋亡抑制及耐药性的产生，导致部分患儿出现治疗失败或复发，因此，有效缓解疾病症状、降低复发率是现代医学工作者的主要目标[3]。

白血病是造血干细胞的复制失去调控而引发的疾病[4]。当机体遭受外界刺激或自身平衡机制发生紊乱时，体内多种不同的生长信号通路被激活。PI3K/Akt信号通路是体内调节生长、分化、凋亡的重要途径，与细胞更替、血管新生等过程有关[5]。选择PI3K/Akt信号通路中分子本身或过程中的相关分子进行研究，是探讨儿童白血病治疗的医学工作者们的研究热点。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

PI3K一抗兔抗(1∶1000)，来自Abcam公司(英国)；兔来源的Akt一抗(1∶5000)，来自Abcam公司(英国)；p53一抗兔抗(1∶5000)，来自Abcam公司(英国)；caspase-3一抗兔抗(1∶1000)，来自Abcam公司(英国)；兔抗来源β-actin抗体和HRP标记的羊抗兔IgG，购自武汉博士德生物工程有限公司；dNTP等，购自美国Promega公司；电子天平，岛津ATX124；低温高速离心机，美国SCILOGEX公司；电泳仪，北京六一厂。

1.2 样本来源

白血病患儿为医院血液内科2016年3月至2017年4月期间住院与门诊的儿童，经过MICM分型(即骨髓细胞形态学、白血病免疫学分型、染色体及C-MYC融合基因)确定，符合FAB诊断系统分型标准，作为实验组。其中45例初治急性白血病患儿(A组)，男26例，女19例，中位年龄6岁；5例复发白血病患儿(B组)，男4例，女1例，中位年龄10岁；10例健康儿童作为正常对照组(C组)，男7例，女3例，中位年龄8岁。3组研究对象年龄、性别等构成情况差异，均无统计学意义(P>0.05)。按照分组，纳入对象均进行骨髓穿刺，收集新鲜骨髓液，并从新鲜骨髓液中分离单个骨髓核细胞(-80 ℃保存)。所有样本的收集均取得郑州大学附属儿童医院伦理委员会批准与儿童监护人的知情同意。

1.3 方法

1.3.1 Western blot测定PI3K与Akt蛋白的表达

加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，4 ℃离心5 min，取上清，BCA法测定蛋白标准曲线后超低温冰箱保存。取蛋白样20 μg，加入足量的蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸10 min，SDS-PAGE电泳后湿转2 h，脱脂奶粉封闭结束后，分别加入兔来源的PI3K/Akt一抗过夜，TBST洗膜5分钟/次，洗3次。二抗孵育(室温1 h)，ECL显影。β-actin作为内参蛋白，采用Band Scan 5.0凝胶电泳图像分析软件对条带进行灰度分析。

1.3.2 用荧光定量PCR测定PI3K与Akt的mRNA表达

按照分组，分别提取骨髓核细胞中的总RNA，严格遵守RevertAid逆转录试剂盒中合成cDNA的方法。在冰浴条件下，往无菌离心管中依次加入5 μL dNTP、4 μL引物、2 μL Taq酶，加新鲜的ddH2O至50 μL。93 ℃预变性5 min，进入循环阶段：93 ℃变性40 s、58 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，循环40次，最后在72 ℃保温10 min后终止反应。引物序列：

PI3K上游引物：5’-CCACCTCTTTGCCCTGAT-3’；下游引物：5’-TCGGTTCTTTCCCGTTAG-3’；

Akt上游引物：5’-ATGAGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3’；下游引物：5’-GAGGCCGTCAGCCACAGTCTGGAT-3’;

β-actin上游引物：5’-TCATCACCATTGGCAATGAG-3’；下游引物：5’-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3’。

1.3.3 血清中乳酸脱氢酶的含量

抽取白血病患儿外周血4 mL，对照组健康儿童手臂空腹静脉血4 mL，分别离心(3000转，10 min)，取上清，放入生化分析仪中测定乳酸脱氢酶的含量。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 Western blot实验结果

与对照组C组比较，初治急性白血病患儿(A组)与复发白血病患儿(B组)中PI3K、Akt、p53蛋白条带逐渐变亮变宽，Caspase-3蛋白条带逐渐变暗，数据结果分析显示，与C组比较，A组、B组患儿的PI3K、Akt、p53蛋白表达水平均明显升高，Caspase-3蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与B组比较，A组PI3K蛋白表达水平明显降低(P<0.05)、Akt蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，而p53、Caspase-3蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1、2，表1、2。

与对照组C比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05

与对照组C比较，*P<0.05

表1 Western blot检测中PI3K/Akt蛋白的

表2 Western blot 检测中Caspase-3/p53蛋白的

2.2 RT-PCR检测PI3K/Akt的mRNA实验结果

A组、B组患儿PI3K、Akt的mRNA含量范围为2.56～3.78，C组儿童组PI3K/Akt的mRNA含量范围为1.02～1.38相比，与C组比较，A组、B组患儿的PI3K mRNA水平、Akt mRNA水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与B组比较，A组患儿PI3K mRNA水平明显降低、Akt mRNA水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3、表3。

与对照组C比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05

表3 RT-PCR测定PI3K/Akt的mRNA表达水平

2.3 血清中乳酸脱氢酶(LDH)的检测结果

与C组比较，A组、B组患儿血清LDH含量均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；A组、B组患儿血清LDH水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 各组血清LDH含量比较

3 讨 论

白血病是一种恶性克隆性血液障碍性系统疾病，白血病的形态学、免疫学、细胞免疫分型等在白血病的诊断过程中具有重要作用[6]。急性髓细胞白血病(AML)是我国幼儿白血病常见类型之一，其中急性单核细胞白血病患儿人数所占AML比例较大。化疗是目前治疗白血病的主要方式，虽然在临床治疗方面取得一定疗效，但是仍有部分患儿从初治急性白血病转为复杂难治性白血病，而复杂难治性白血病患儿的预后差、生存期短。因此，亟需研制新药物用于治疗白血病。

LDH是由糖酵后形成乳酸、被氧化成丙酮酸，在人体心脏、肺、骨骼肌、肝、肾、脾组织中广泛存在[7]。研究表明，机体组织出现癌变造成细胞生长失调，过多的LDH向周围组织转运、扩散、进入，刺激组织出现反应性LDH大量释放，从而反应肿瘤细胞的增殖情况[8]。已有研究显示LDH含量升高是初诊急性白血病患者肿瘤溶解综合征的发病危险因素[9]，还有学者认为初诊时LDH水平异常升高是儿童伯基特白血病的预后不良因素[10]，本研究发现，初治急性白血病患儿与复发白血病患儿血清中LDH的含量明显高于对照组中健康测试儿童的含量，由此推测LDH含量异常升高可能对白血病患儿疾病治疗效果、预后评估有一定的参考价值。

PI3K/Akt是细胞生长与分化的重要通路之一[11]。在细胞外活性因子的刺激下，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)与相关受体结合，如胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)等，被激活，吸引产生3,4二磷酸磷脂酰肌醇和3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇向细胞膜靠近，募集蛋白激酶B(serine/threonine kinase，AKT)，形成二聚体使AKT进入活化状态，激活的AKT从细胞膜上解离下来，释放入细胞浆内继续传递生物学信号，启动细胞核内生长与分化信号[12-13]。Akt是一类丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，活化后可直接启动生长基因的大量表达[14]。受到大家广泛关注的p53，是一个重要的肿瘤抑制因子，50%以上的恶性肿瘤中被发现有该基因的突变。当细胞受到外界刺激或自身功能出现障碍时，p53基因启动表达转录因子，进而调控细胞的生长，决定细胞进入正常分裂还是走向凋亡[15]。有研究表明，正常情况下，p53为重要的肿瘤抑制基因，当其发生突变后，分子构象发生改变，从而失去对细胞生长与凋亡的调控作用，突变为癌基因，转为主动的致癌[16]。Caspase-3为一类蛋白酶，参与DNA修复、基因完整性监护，为细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，其作用不可替代；Caspase-3最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP〔poly(ADP-ribose) polymerase〕[17-18]。本研究发现，白血病患儿体内 PI3K/Akt含量较健康儿童显著性偏高，p53含量明显偏高，Caspase-3含量显著减少。除调控PI3K/Akt信号通路来控制细胞的生长，突变的p53大量表达促进癌细胞生长，Caspase-3无法及时清除大量的多聚聚合酶，无法满足减缓细胞生长的步伐，造成体内造血干细胞大量复制。因而，控制p53/Caspase-3含量变化，可为调控PI3K/Akt信号通路提供另一种方法。

综上所知，在白血病的分子治疗过程中，将PI3K/Akt信号阻断剂作为优先考虑方向，通过下调PI3K/Akt蛋白的表达，起到减弱白血病患儿造血干细胞恶性复制的情况。