关于机体抵抗戊型肝炎病毒的免疫机制研究进展

金 丽，郭富城，苏 强，张德荣，刘俊林，胡永浩，周建华，马晓霞，李 倬*

（1. 西北民族大学 生物医学研究中心，甘肃 兰州 730030；2. 西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；3. 甘肃农业大学 动物医学学院，甘肃 兰州 730070）

戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是HE 病毒（HEV）引起的以粪-口途径传播为主的传染性疾病，该病毒所引起的临床感染症状主要表现为急性肝炎[1]。其病原HEV 是一种单股正链的RNA 病毒，目前已经发现8 种HEV 基因型（HEV-1～HEV-8），其中HEV-1 和HEV-2 只能感染人类，而HEV-3 和HEV-4 的侵染宿主谱很广（包括人、家畜以及野生动物）。此外，HEV-5 和HEV-6 主要于野猪上分离获得，而HEV-7和HEV-8在骆驼体内分离获得[2]。猪在HEV跨宿主交叉感染中发挥重要作用，具有特殊的遗传进化特点[3]。HEV 作为一种人畜共患性传染病，能够在人类和动物中广泛分布和传播并在自然界的易感宿主呈现多样性。相关研究发现，从骆驼体内分离的HEV-7 能使得肝移植患者引发慢性HE[4]，同时，器官移植病人若食用野味肉也可加大HEV 感染的风险[5]。据报道将患有HE 猪所产的猪粪用来为草莓及蔬菜提供肥料时，也会引发食用者感染HEV 的风险[6-7]。该病在人群中引起的致死率仅占1%，但一旦感染怀孕妇女，其死亡率却能达到20%[8]。在家禽感染方面，感染HEV 会导致30 周龄～72 周龄的肉种鸡与蛋鸡的产蛋率下降，部分鸡腹部充血、卵巢退化，有的肝脾肿大[9]。由此不难发现HEV 感染已经成为当今各国密切关注的公共卫生问题，由于HEV 感染和宿主的限制性分子机制目前尚不清楚，本文将对其如何抵抗宿主免疫进行初步探讨。

宿主免疫系统在机体对抗病毒性病原体侵染方面起着中流砥柱的作用。免疫系统对病毒产物诱导产生的抗病毒细胞因子，如I 型干扰素（Interferon，IFN）和肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）迅速做出反应，从而延缓并最终对病毒侵染进行抑制。这些天然抗病毒反应对于激活针对特定病毒侵染的适应性免疫反应来说是至关重要的，相应的固有免疫反应包括病毒特异性B 细胞和T 细胞的生成，机体通过这些B 细胞和T 细胞来清除机体内的病毒[10]。但是近些年来，利用细胞感染模型、动物感染模型以及一定数量的机体研究HEV致病机制的过程中发现，HEV侵染的过程中与宿主发生着十分复杂的互作过程。由此本篇我们将探讨近些年天然免疫以及适应性免疫在HEV致病机制方面发挥的作用。

1 IFN 在天然免疫反应中的抗病毒作用

1.1 病毒感染产生IFN 反应病毒与宿主之间是相互作用并共同进化的，病毒与宿主受体结合是病毒感染宿主的关键因素。HEV 一旦成功侵入机体，可通过相关模式识别受体（Pattern-recognition receptor，PRR）识别病毒的核酸与蛋白质等病原相关分子模式。能够识别外源RNA 的模式受体家族有RIG-I 样受体（包括RIG-I 以及MDA5）以及Toll 样受体（Toll-like receptors，TLR），它们可以识别细胞质及内体（Endosomal compartment）中存在的外源RNA。而TLR 家族中有13 种受体分子，其中TLR3、7 和8 是负责探测外源病毒性RNA的胞内感受器[11]。RLR 受体家族以及TLR 受体家族成员识别病毒RNA 后激活由干扰素调节因子（Interferon regulatory factor，IRF）3、IRF7 及NF-κB 介导的下游信号通路。最终，这些信号通路促进了IFN 及促炎细胞因子（Pro-inflammatory cytokines）的产生[12]。

当相关细胞因子产生后，IFN 激发的信号通路通过自分泌（Autocrine）和旁分泌（Paracrine）通路对病毒侵染进行抵抗。IFN 结合到特定的细胞受体可以激活广谱抗病毒免疫通路（JAK-STAT 通路）。STAT1 与STAT2 蛋白被磷酸化修饰后与IRF9 分子结合构成IFN 刺激基因因子3（Interferon stimulated gene factor 3， ISGF3），而后入核诱导数百种INF 刺激基因（Interferon stimulated genes，ISGs）转录活化[10,13]。由于ISG 是抗病毒的最终效应分子，所以当不同种类的ISG 通过联合互作能够对形形色色的病毒构成一道抗病毒免疫屏障[14]。面对机体强大的抗病毒免疫屏障，包括HEV 在内的许多病毒在进化过程中逐渐演化出了破坏IFN 的合成及IFN 激活的JAK-STAT 信号通路的策略[15]（图1）。

1.2 HEV 对IFN 生成的诱导和阻滞RIG-I 和MDA5 可以在HEV 侵染机体后快速被激活，而相对于I 型IFN 被诱导产生的情况来看，HEV 感染主要诱导产生III 型IFN[16]，说明在HEV 侵染过程中，III型IFN 发挥主要的抗病毒作用，这与其他的RNA 病毒不同[17]。RIG-I 与TLR3 对开启机体抵抗HEV 的复制起着至关重要的作用，并且IRF3 在下游通路激发的过程中起到决定性作用[18]。这也反映出HEV 与宿主共进化的过程中机体已经形成了一套独特的对HEV 进行识别并激发下游抗病毒通路的模式。

HEV-4 基因组中ORF3 可以诱导信号调节蛋白α（Signal regulator protein α， SIRP-α）的 表 达， 而SIRP-α可以阻断IRF3 的磷酸化过程以及IFN-β的合成[18]。这也是在HEV 感染早期，机体诱导IFN-β总是处于低水平的分子机制。HEV 基因组结构ORF1中存在一个X 结构域（X domain），它可以阻止poly（I·C）诱导IRF3 的磷酸化，而PCP 结构域通过泛素化抑制RIG-I 和TBK-1 的活性，阻止IFN 合成，由此直接导致ISG 的诱导表达[19-20]（图2）。然而，体外细胞培养以及人源化小鼠（Mice with humanized liver）进行的实验研究表明，HEV 感染可以开启ISG 诱导表达的生物学过程[21]。这也就说明了虽然HEV 感染能够抑制IFN 的合成，但是这种IFN 抑制作用并不是绝对的，仍然会有少量IFN 诱导生成，从而激活ISG 的表达。有趣的是，以大猩猩为研究模型，分析发现HEV 急性感染后诱导产生ISG 的能力明显低于丙型肝炎病毒（HCV）感染后所诱导产生ISG 的能力[22]，进一步说明HEV 可以抑制IFN 生成。

图2 HEV 基因组结构[20]

HEV-1 和HEV-3 的基因组结构ORF3 所表达的蛋白产物对IFN-β的产生和RIG-I 受体活化具有明显的刺激作用。目前仍然对ORF3 介导IFN-β产生的诸多环节尚不清楚，似乎HEV 在对IFN 合成促进和抑制之间发挥着调节平衡的作用，从而使受感染的机体在病毒不同生命周期中处在最佳的抵抗环境。此外，在IFN 诱导和抑制方面，HEV 不同基因型所展示出来的偏嗜性也不同[23]。

2 IFN 信号通路引起的ISGs 在HEV感染过程中的作用

利用截面微阵列（Cross-sectional microarray）检测技术检测患有慢性肝炎的肾脏器官移植患者的血液样本，鉴定出有25 种ISG 上调表达，这些上调表达的ISG 是与病毒持续性感染有关[24]。这也给研究人员提出了一个新问题，ISG 表达水平的变化是否是病毒与宿主互作或者是宿主抵抗病毒侵染的一种表征现象？

许多ISG 在IFN 未被刺激表达的情况下在细胞内存在特定的本底表达水平。在抵抗HEV 复制方面，这种IFN 信号转导产生的ISG 本底表达水平发挥重要作用。当利用RNA 干扰技术使JAK1 基因表达沉默后，ISGF3 复合物能够促进HEV 的复制[25]。研究人员发现在STAT1、STAT2 及IRF9 表达量较低的细胞中ISG 低表达能够使HEV 复制增加[25]。在没有IFN 激活的情况下，未被磷酸化修饰的ISGF3 复合物是维持ISG 本底表达的前提条件，这为病毒侵入机体后做出抗病毒应答提供了物质保证[26]。通过基因敲除实验或者外源基因过表达实验，研究人员进一步证实在特定病毒或者是广谱病毒谱侵入方面，抗病毒ISG 扮演着重要角色。其中，在对抗病毒显著的ISG 研究发现，RIG-I、MDA5 以及IRF1 是抗击HEV 侵染中重要的效应分子[27]，但是值得注意的是众多IRF1 与RIG-I 激活的ISG 表达并不需要IFN诱导刺激，就能够激活宿主免疫系统发挥抗病毒机制作用。

3 TNFα与NF-κB 信号转导通路

宿主免疫系统对病毒感染的应答导致许多细胞因子产生，这些细胞因子在疾病活动过程中发挥一定作用，比如促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素-6（IL-6）以及转化生长因子-β1（TGF-β1）等在肝脏疾病的病理生理中发挥重要作用[28]。由于细胞因子基因在特定位点呈多态，这与位于编码和调节区内的某些突变与特定细胞因子的更高或更低产生有关。已有报道表明，细胞因子基因多态性与炎症，自身免疫和感染性疾病之间的关联有关[29]。而且，研究人员观察到TNFα 和IFN-γ的多态性在HEV 感染发病机制中发挥的作用，在TNFα 启动子区308 位点G/A 基因多态性与HEV 感染机体的易感性以及HEV 感染机体后的不同临床表现的发现，308 位点A 等位基因频率较高对HEV 的易感性和急性肝衰竭的致命性结果以及TNFα 308 位点的AA 基因型与HEV 感染易感相关[30]。同时，不同细胞因子在病毒感染机体后对生殖及妊娠过程中起着关键作用，研究人员进一步对患有HEV感染的已孕机体与未感染HEV 的机体相比，早产机体的TNFα多态性位点中，308位点中A的等位基因与AA基因型频率更高，并且TNFα的表达量也极高[31]。以上研究表明，机体对HEV 侵染敏感性差异与TNFα启动子序列区的遗传多态性相关。然而，其他研究者又通过HEV 感染肺上皮细胞后，经转录组测序发现炎症细胞因子表达水平显著增加，包括IL-6、IL-8以及TNFα。其中，TNFα可以抑制HEV 复制活性，当TNFα与IFN-α结合后可进一步促进诱导ISG 的产生，从而增强其对HEV 的抗病毒活性。同时TNFα还可以通过激活NF-κB 信号通路来诱导ISG 的表达，这也可能与IFN 在HEV 感染过程中所发挥的抗病毒效果起到协同效应[32]。

另外，HEV 在长期的进化选择过程中已经形成了破坏NF-κB 信号转导通路的能力。HEV 病毒基因组结构ORF3 含有的P2 结构域可以抑制TLR3 与TLR4 激活的NF-κB 信号转导通路，导致炎症细胞因子（包括TNFα、IL-8 和IL-1β）的表达水平显著降低，这是由于TNF 受体1 相关死亡结构域蛋白活性受阻以及受体互作蛋白激酶1 泛素化降解所导致[33]。与此同时，HEV ORF3 的P2 结构域还可通过诱导NF-κB 信号转导阻遏物A20 蛋白的活化来阻止TNFα激活NF-κB 介导的信号通路。HEV 基因组结构ORF2 蛋白阻止IκBα降解也可以破坏NF-κB 介导的信号通路。以上研究均表明，HEV 已经通过遗传进化形成了一套成熟的策略来阻止TLR 或者TNFα诱导NF-κB 介导的信号通路，从而实现免疫逃避[34]。

4 天然免疫细胞在HEV感染中的作用

最近，HEV 感染机制已经在细胞免疫水平进行深入研究，并产生一系列新的进展。但是在HEV 感染过程中，不同种类免疫细胞所发挥的免疫学作用的归类与鉴别却不多。与正常对照机体相比，在急性HEV 机体的外周血中，自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK）和自然杀伤T 细胞（Natural killer T cell，NKT）的数量明显下降，而在恢复期（Convalescent phase），这些急性HEV 机体内的外周血中的由NK 和NKT 激活的高表达活性标识物恢复到正常水平[35]。目前还不清楚处于急性HEV 感染的机体外周血中低表达NK 和NKT 细胞是否是由于大量相关细胞迁移至肝脏的炎症部位从而发挥相应的功能所引起的。还有学者研究发现，当HEV-1 感染机体时，其基因组ORF3 能够抑制机体外周血来源的树突状细胞（Dendritic cells，DC）的成熟，抑制DC 分泌IFN-β、IL-10 和IL-12 等细胞因子，使得DC 对T 淋巴细胞的增殖刺激作用减弱，从而使机体对HEV的免疫反应下降，实现免疫逃避，这有可能导致了HE 临床症状发生改变[36]。因此，未来研究将聚焦天然免疫细胞在HEV 感染中发挥的具体作用，尤其是NK、NKT 以及DC在抗病毒感染中所发挥的重要作用。

5 机体抵抗HEV 的体液免疫

非人类灵长动物感染模型感染HEV 后，其体内可以产生针对HEV 的特异性抗体并且对再次病毒侵染具有完全的保护能力。早期HEV 感染并表现出急性症状的时候，机体能够诱导特异性抗体的分泌[37]。典型急性HEV 感染中，特异性识别HEV 的IgM 在6 到8 周迅速达到顶峰，并且在5 个月后IgM水平降低到无法检测出来。而IgG 在体内分泌水平从急性期到恢复期稳定提升并且在体内维持很长时间来防止机体再次受到HEV 的侵染。

HEV 作为一种无囊膜的RNA 病毒，基因组结构ORF2 所编码的蛋白是其唯一的病毒衣壳蛋白，并且HEV 主要的抗原位点均是存在于该病毒衣壳上，这也是机体产生中和抗体的主要靶点。利用HEV ORF2 重组蛋白对禽进行免疫后可以获得抗ORF2 抗体，还可起到抗禽HEV 感染的免疫保护作用[38]。然而，在感染HEV 的机体内能够检测到类囊膜病毒粒子（Quasi-enveloped virion）。HEV 病毒颗粒在胆汁和粪便中是无囊膜的，而在血液和细胞培养上清中产生的病毒粒子衣壳上可以粘附来自于细胞膜的脂类物质[39]。这些粘附于HEV 病毒衣壳上的脂类物质可以有效干扰中和抗体对HEV 病毒粒子的结合活性，从而实现对体液免疫的逃避。

具有保护作用的抗体反应无论是在HEV 疫情呈现暴发性还是散发性的地区都是有效的。针对HEV的IgG 在地区性HEV 感染流行地域的已孕机体进行被动免疫可以有效预防HEV 的侵袭。在现有的记录中，针对HEV 的IgG 可以在5 至14 年前暴发过HEV地区的机体体内检测到，但是也有报道称抗HEV IgG 呈现出有序地大幅度降低的情况。这些现象反映了反复自然感染HEV 是机体维持针对HEV 免疫活性的原因，但是在一个特定区域HEV 反复暴发流行却可以使HEV 特异性抗体水平呈现递进式降低的趋势[40]。

6 特异性T细胞在HEV感染中的作用

6.1 针对HEV 的特异性T 细胞免疫反应HEV 导致的急性感染机体内可以检测到特异性针对HEV 的CD4+和CD8+T 细胞免疫反应。我们对这些具有抗HEV 感染免疫学活性的T 细胞在增殖分化以及产生相关细胞因子（例如TNFα和IFN-γ）产生的机制已有初步了解。值得注意的是，由于各种研究的手法和观察角度的差异，对于T 细胞免疫相关活性的强度和谱系的认识也是多种多样。对急性HEV 患者分析发现，机体体内在初次感染前几周针对HEV 的特异性T 细胞的反应迅速降低。同样的结论在HEV 感染的机体，即在灵长类动物实验模型中也能观察到，HEV 被机体清除数年后，针对HEV 的记忆性T 细胞仍旧长期存在于宿主体内[41]。HEV 特异性T 细胞游走进入肝脏内部，其细胞毒性作用（穿孔素和颗粒酶）也会对肝脏造成损伤。对HEV 急性感染引起的肝衰竭病例活检可以观察到CD8+T 细胞进入肝脏中，并且调控细胞因子活性相关的基因呈高水平表达。此外，在这些被HEV 感染的机体的肝脏中还发现了少量能够诱导TNFα和IFN-γ产生的CD4+T 细胞，但目前尚不清楚这些温和的免疫反应是否也会促进肝脏衰竭[42]。这都说明T 细胞反应与HEV 引起的肝脏免疫性病理变化是直接相关的。

文献报道已经鉴定出能够激活T 细胞活性的主要抗原表位，HEV ORF2 编码的蛋白产物中存在一个可以特异性激活T 细胞活性的保守抗原表位决定簇[43]。研究发现，感染HEV-3 机体的T 细胞可以对来源于HEV-1 的抗原表位决定簇产生免疫反应，说明这一保守特异的抗原表位决定簇能够实现HEV 不同基因型病毒之间的交叉保护作用[41,43]。感染HEV机体的临床治疗促使机体产生特异性T 和B 细胞的免疫反应，给HEV 带来了很强的选择压力，从而促进了病毒的变异和准种（Guasispecies）的产生[3]。这也是导致不同HEV 基因型和变异株在对宿主侵染谱和致病性上存在差异性的原因。

6.2 HEV 感染过程中引起的T 细胞衰竭现象HEV感染所产生的高强度持续性抗原刺激会使T 细胞活性出现衰竭，这直接影响到免疫细胞分化以及细胞因子的产生。在病毒性慢性感染中，T 细胞功能的异常会导致调节性T 细胞和IL-10 产生副调控信号以及抑制受体因子（例如PD-1 和CTLA-4）表达的上调[44]。T 细胞衰竭可能减轻感染宿主的免疫病理变化的程度，这同时也有利于病毒复制增殖。

有研究结果表明，慢性感染HEV 体内的T 细胞功能异常主要是由于HEV 抗原水平较高所致[45]。相反，HEV 感染的患者被治愈后，免疫细胞增殖与IFN-γ的产生均能很快恢复到正常水平。这与康复患者体内的外周血淋巴细胞免疫活性相比，器官移植患者感染HEV 转变为慢性肝炎时，能够诱导机体产生大量的IL-10[44]。同时也说明IL-10 对于T 细胞活化是非常重要的，急性感染HEV 机体的外周血淋巴细胞中能够高表达CD4+、CD25+、Foxp3+以及IL-10[46]。以上研究结果为调节性T 细胞（Treg）和IL-10 的免疫学功能研究奠定基础，也为急性HEV感染与慢性肝炎研究奠定理论基础。

7 结论与展望

大量关于HEV 感染引发的天然免疫与适应性免疫机制的研究为抗病毒研究奠定了基础，但目前仍有很多空白亟待解决。将来研究应着眼于HEV 体内清除及其临床症状相关的免疫病理机制研究，包括NK 细胞、DC 细胞及巨噬细胞在内的细胞免疫学研究，这将对机体感染HEV 初期所激发的T、B 细胞的抗病毒反应意义重大。很多关于T 细胞免疫在抗击HEV 感染的研究都是基于患者外周血淋巴细胞开展的，但是HEV 毕竟是肝炎病毒，很多临床症状都是由于肝脏病理变化导致的免疫学反应。肝脏内部微环境的改变将会直接影响机体免疫反应对HEV 感染的应答，这就需要研究人员以肝脏为研究靶器官来开展HEV 致病机制的相关研究。进一步研发和推广HEV 疫苗及新型治疗技术对于在世界范围内控制HEV 流行将具有深远意义。