炭疽杆菌RPA 等温检测方法的建立和应用

王素华，袁淑辉，帅江冰，王忠才，蔡 军，赵治国

（1. 温州海关综合技术服务中心，浙江 温州 325027；2. 杭州海关技术中心，浙江 杭州 310016； 3. 呼和浩特海关技术中心，内蒙古 呼和浩特 010020）

炭疽杆菌（Bacillus anthracis）是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，可引起人畜共患的炭疽病，是世界动物卫生组织（OIE）确立的必须通报的动物疫病。炭疽杆菌具有高致病性，对人和动物的健康和生命构成极大威胁，常被用作生物恐怖战剂，其快速而精确的检测一直备受重视[1]。目前炭疽杆菌检测的常用方法，主要是对病原体进行培养、染色镜检、血清学（抗原或抗体）检测等，但这些检测方法耗时较长，难以适应快速诊断和控制疫情的需要。

重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase polymerase amplification，RPA）是一种新型的等温扩增技术[2]。RPA 主要依赖于重组酶、聚合酶、单链结合蛋白等实现对靶基因的等温扩增。在反应过程中，重组酶结合引物形成蛋白-DNA 混合物并启动寻找模板DNA 上的同源序列。同源序列定位后，则会引发链置换反应，引物结合到对应模板上，聚合酶进而从引物3'末端开始启动DNA 合成。同PCR 一样，两条引物可以启动对靶基因的对数级扩增[2]。本研究以炭疽杆菌BA5345 基因为研究对象，设计特异性引物，建立了能够快速、有效检测炭疽杆菌的RPA 等温检测方法，旨在为炭疽的防控和诊断提供一种新的、可靠的技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌株及临床样品炭疽杆菌疫苗株（A16R）购自兰州生物制品有限公司； 蜡样芽孢杆菌（BNCC124613）、苏云金芽孢杆菌（BNCC221700）、蕈状芽孢杆菌（BNCC184427）和魏氏芽孢杆菌（BNCC189983）购自国家兽医微生物菌种保藏中心；变形杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌由杭州海关技术中心惠赠。炭疽杆菌基因组DNA 由本实验室保存。临床样品为实验室自制污染生皮毛样品。

1.2 主要试剂Quick-DNATM提取和纯化试剂盒购自美国ZYMO RESEARCH公司；质粒DNA小量抽提试剂盒、pUC57 Vector、大肠杆菌DH5α和Amp购自生工生物工程（上海）股份有限公司；TwistAmpTMDNA amplification Kit 购 自 英 国Twist Dx 公 司；Taq DNA 聚 合 酶（5 U/μL）、dNTPs（10.0 mmol/L）、MgCL2（25 mmol/L）、DL500 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DNA 胶 回收试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；炭疽杆菌荧光定量PCR 检测试剂盒购自广州维伯鑫生物科技有限公司。

1.3引物设计炭疽杆菌BA5345 基因序列（FJ694154.1）常规PCR 引物的设计与特异性位点的选择参考王素华等的方法[3]，同时选择该基因特异性保守区域，设计RPA 引物，引物序列见表1。引物由上海华大基因科技有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 炭疽杆菌BA5345 基因重组质粒标准品的制备以炭疽杆菌基因组DNA 为模板，以BA5345-F/BA5345-R 为引物，参考王素华等[3]建立的常规PCR方法扩增BA5345 基因片段，预期扩增的BA5345 基因大小为510 bp。将扩增的目的片段回收纯化后与pUC57 载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落经PCR 和测序鉴定，获得pUC57-BA5345 阳性质粒。通过Nano Drop 2000 测定质粒的DNA 浓度，按照公式（6.02×1023拷贝/mol）×质粒浓度（ng/μL）×10-9/（DNA 长度×660）=拷贝/μL 换算为拷贝数，作为pUC57-BA5345 质粒标准品备用。

1.5 RPA 方法的优化分别对10 mmol/L 的引物使用量和反应时间进行优化。采用Twist Amp Basic Kit配制50 μL RPA反应体系，并在如下范围内进行优化：10 mmol/L BA5345-F1/BA5345-R1 各1.0 μL～5.0 μL、Rehydration Buffer 29.5 μL，MgAc（280 mmol/L）2.5 μL，模板1.0 μL，加灭菌去离子水补至50.0 μL。将模板和MgAc 之外的所有试剂预混后转入含有冻干酶制剂的0.2 mL 反应管中，并充分混匀。将1.0 μL 模板和2.5 μL MgAc 加入反应管中，盖紧管盖，瞬时离心并旋涡后，放进39 ℃水浴锅中反应，反应时间设置为10 min、20 min、30 min 和40 min。利用DNA 纯化试剂盒对RPA 产物进行纯化，取5 μL 产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 常规PCR 扩增用于炭疽杆菌检测的常规PCR 引物序列见表1，PCR 的反应体系为：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTPs（10.0 mmol/L）1.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，正、反向引物（25 pmol/μL）各1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，模板DNA 4.0 μL，灭菌去离子水补至50.0 μL。反应条件为：94 ℃3 min；94 ℃30 s、55.0 ℃30 s、72 ℃45 s，35个循环；72 ℃10 min。

1.7 特异性试验将炭疽杆菌疫苗株、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、魏氏芽孢杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌在绵羊血琼脂平板上37 ℃培养48 h～72 h，用灭菌的接种环从血琼脂平板上各挑取一环新鲜菌落，加入到盛有25.0 μL 灭菌去离子水的1.5 mL 离心管中制成菌落悬液，95 ℃作用2 min 后于冰浴中冷却至4 ℃左右，Quick-DNATM提取和纯化试剂盒提取基因组DNA。以提取的DNA 作为模板，根据1.5 建立的RPA 方法进行特异性试验。

1.8 敏感性试验将重组质粒pUC57-BA534510 倍倍比稀释，使其浓度在106拷贝/μL 至100拷贝/μL 之间，并以此为模板进行RPA反应，确定该方法的敏感性。同时参照文献[3]进行常规PCR检测，利用荧光定量PCR试剂盒进行荧光PCR检测，比较三者敏感性。

1.9 RPA 方法的应用将3×106cfu/mL 炭疽杆菌疫苗株芽孢悬液，10 倍倍比稀释为7 个不同浓度（3×106cfu/mL～3×100cfu/mL）后各取200 μL 随机加入到1 g 生皮毛样品中，振荡混匀10 min，4 ℃放置过夜，使芽孢与皮毛充分吸附，即为污染皮毛，共制备35 份样品，分为7 组，每组5 份样品，每组样品炭疽杆菌的添加浓度分别为3×106cfu/mL～3×100cfu/mL；同时设置5 份已知炭疽杆菌阴性的皮毛样品作为对照。污染皮毛样品中分别加入5 mL 0.5%TritonX-100 蔗糖PBS 溶液，充分混匀，室温震荡10 min，1 000 r/min离心5 min 去除皮毛中大的颗粒，取上层悬液用PBS溶液进行10 倍稀释后，12 000 r/min 离心5 min，弃上清，再用PBS 溶液洗涤2 次，200 μL PBS 溶液重悬，悬液中即为炭疽芽孢。提取35 份污染样品和5份阴性样品的DNA 作为模板，分别采用本研究建立的RPA 方法、常规PCR 方法[3]、荧光定量PCR 试剂盒同时检测，计算三者的阳性检出率，并比较三者的检测结果。

2 结 果

2.1 炭疽杆菌BA5345 基因重组质粒标准品的鉴定结果以提取的炭疽杆菌基因组DNA 为模板，以BA5345-F/BA5345-R 为引物进行PCR 扩增。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测显示，目的片段约为510 bp，与预期大小一致，经测序验证，结果表明重组质粒标准品pUC57-BA5345 构建正确，测定重组质粒浓度为45 ng/μL，换算成拷贝数为8.0×1010拷贝/μL。

2.2 RPA 方法的优化结果经反应体系和反应条件优化，最终确定了炭疽杆菌BA5345 基因RPA 反应体系为10 mmol/L 的BA5345- F1/BA5345-R1 各2.0 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL，MgAc（280 mmol/L）2.5 μL，模板1.0 μL，加灭菌去离子水补至50.0 μL。最佳反应时间为30 min（图1）。

图1 炭疽杆菌检测时间优化结果Fig.1 Optimization of the RPA reaction time for Bacillus anthracis detection

2.3 特异性试验结果以炭疽杆菌疫苗株、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、魏氏芽孢杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的DNA 作为模板进行RPA 反应，结果显示，只有炭疽杆菌疫苗株扩增出目的条带，其余均未出现特异性扩增（图2），表明该方法具有较强的特异性。

图2 特异性试验结果Fig.2 Specific test of RPA for Bacillus anthracis detection

2.4 敏感性试验结果将浓度为8.0×106拷贝/μL 的pUC57-BA5345 质粒标准品10 倍倍比稀释至7 个浓度（106拷贝/μL～100拷贝/μL），按照所建立的条件，进行RPA 敏感性试验，并与常规PCR、荧光定量PCR 试剂盒的检测结果进行比较。结果显示，RPA和荧光定量PCR 试剂盒对重组质粒标准品检测限一致，均为102拷贝/μL（图3、图5），而常规PCR 检测限为104拷贝/μL（图4）。表明本研究建立的方法敏感性较高。

图3 RPA 敏感性试验结果Fig.3 Sensitivity test of RPA for Bacillus anthracis detection

图4 常规PCR 敏感性试验结果Fig.4 Sensitivity test of conventional PCR for Bacillus anthracis detection

图5 荧光定量PCR 敏感性试验结果Fig.5 Sensitivity test of Real-time PCR for Bacillus anthracis detection

将浓度为3×106cfu/mL 炭疽杆菌疫苗株芽孢悬液进行10 倍倍比稀释为7 个浓度梯度后各取200 μL提取基因组DNA，按照所建立RPA 方法、常规PCR方法和荧光定量PCR 试剂盒进行扩增。结果表明，RPA 的检测限为3×102cfu/mL，同荧光定量PCR 方法检测限一致，而常规PCR 检测限为3×104cfu/mL。

2.5 临床样品的检测结果在35 份由炭疽杆菌疫苗株芽孢悬液污染的生皮毛样品中，RPA 方法的阳性检出率为65.71%（23/35），略低于炭疽杆菌荧光定量PCR 试剂盒的阳性检出率71.43%（25/35），明显高于常规PCR 的阳性检出率42.86%（15/35）；在5份常规PCR 和炭疽杆菌荧光定量PCR 试剂盒均未检出炭疽杆菌的的阴性样品中，RPA 方法也未检出炭疽杆菌。

表2 临床样品检测结果Table 2 The detection results of clinical samples

3 讨 论

炭疽是严重威胁人类健康的烈性传染病，其病原体为炭疽芽孢杆菌[4]。炭疽芽孢杆菌在我国公布的《人间传染的病原微生物名录》中被列为第二类病原微生物（高致病性病原微生物），其芽孢可作为生物战剂和生物恐怖的原材料，因此发展灵敏、高效的炭疽杆菌检测方法十分重要和紧迫。

快速、精准的诊断是有效防控动物疫病的基础和必要条件。目前已经建立了多种用于炭疽杆菌芽孢检测的分子生物学方法。刘东立等建立了Taq-Man-LNA 探针多重荧光定量PCR 检测方法[5]；徐超等建立了炭疽杆菌TaqMan-MGB 探针检测方法[6]；谭维国等建立了双重荧光定量PCR 方法[7]。这些检测方法的特异性强、敏感性高，但也存在不足之处，如荧光定量PCR 方法需要经验丰富的技术人员和昂贵的PCR 仪[8-10]，反应过程中需要复杂的温度变化，反应时间相对较长，或者需要复杂的引物和探针设计，反应试剂需要冷链运输和保存等。与PCR 方法相比，RPA 具有以下优势[11]：①试剂使用方便，易于保存，RPA核心试剂以冻干颗粒形式保存，从而避免了冷藏保存和冷链运输的必要；②RPA 反应时间短，30 min 内RPA 即可完成对炭疽杆菌靶基因的扩增，而PCR 一般需要60 min 以上；③等温扩增，RPA 属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，一台水浴锅即可完成反应。

目前，RPA 技术已被广泛应用于动物疫病病原的快速检测，如Aebischer 等应用RPA 技术快速检测牛病毒性腹泻病毒[12]；Ahmed 等建立了RT-RPA 方法快速检测口蹄疫病毒[13]；刘立兵等建立了RPA 方法检测猪细小病毒；哈登楚日亚等用RPA 检测方法快速检测非洲猪瘟病毒[14]。本研究基于炭疽杆菌BA5345 基因建立了有效检测炭疽杆菌的RPA 方法，在39 ℃水浴锅中反应30 min 即可实现对目的基因片段的有效扩增，对重组质粒pUC57-BA5345 的最低检测限为102拷贝/μL。在对RPA 反应时间进行摸索时发现，在反应10 min 后可得到少量的扩增产物，在反应30 min 后，即可得到大量的扩增产物，条带清晰。利用本研究建立的RPA 方法对35 份污染样品进行检测，检测的阳性率（65.71%）较常规PCR 检测的阳性率（42.86%）更高，表明本研究建立的炭疽杆菌RPA 检测方法比目前常用的PCR 方法更加准确。

由于炭疽杆菌致病性强，快速、准确的诊断该病，尽早发现并处理传染源，是防控炭疽的重要和有效手段。本研究首次建立了一种检测炭疽杆菌的RPA 等温扩增检测方法，对设备的要求低，结果准确可靠。该方法特异性强、敏感度高、操作简单、反应速度快，适用于兽医诊断实验室和养殖场现场的炭疽杆菌检测，尤其是在资源匮乏的边缘地区养殖场的现场检测。