河北地区水貂源大肠杆菌的分离鉴定及致病性与耐药性研究

刘勃兴，赵安奇，柳翠翠，付 祥，刘 畅，李 浩，史秋梅，张志强

（河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛 066004）

水貂大肠杆菌病是水貂养殖过程中的一种常见疾病，具有较高的发病率与死亡率，制约水貂养殖业的健康发展。感染致病性大肠杆菌的水貂临床症状有高热、腹泻下痢、肺炎、败血症等，并常与其它病原微生物造成混合感染或继发感染[1-3]。在大肠杆菌所致疾病的防治过程中，抗生素类药物起着重要作用[4]。但随着抗生素耐药菌株的出现以及传播，给临床治疗大肠杆菌病带来很大困难，并对养殖业的健康发展和人类公共卫生安全造成了严重威胁[5]。

河北省是我国毛皮动物养殖大省，该地区水貂养殖同样受到致病性大肠杆菌的困扰。本研究对2019 年上半年从河北地区112 份水貂病料中分离到的24 株水貂源大肠杆菌的致病性以及耐药性进行研究，旨在为河北地区该病的防控提供数据支持，对水貂源大肠杆菌致病性与耐药性相关研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源2019 年上半年，由河北地区秦皇岛、唐山、保定等养殖场送检的病死水貂，临床表现主要为咳嗽，痉挛，口鼻出血等，剖检肺脏、肝脏等器官有明显败血症，初步诊断为大肠杆菌感染。无菌采集病死水貂肝脏（67 份）、脾脏（30 份）、肺脏（15 份）等器官样品共112 份。

1.2 主要试剂伊红美蓝培养基，购自北京陆桥科技股份有限公司；药敏纸片，购自杭州天和微生物科技股份有限公司；DL2000 plus DNA Marker，购自中科瑞泰科技有限公司；2×Taq Master Mix、细菌DNA 基因组提取试剂盒，购自康为世纪生物科技有限公司；ID32E 生化鉴定试纸条，购自法国梅里埃公司；洁净级昆明小鼠（体质量20±2 g），购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.3 细菌的分离鉴定将肝脏、脾脏、肺脏等病料样品接种于LB 平板上，挑取优势菌落进行细菌的分离培养后，并将纯化后的菌株接种到伊红美蓝鉴定培养基培养。挑取单菌落至玻片上，按照革兰氏染色试剂盒说明书染色后经显微镜观察结果并记录。利用ID32E 生化鉴定试纸条对分离菌株进行生化鉴定并用ATB自动生化鉴定系统对结果进行判定。

1.4 分离菌的16S rDNA 基因的PCR 扩增及序列分析由上海生工生物工程公司合成细菌16S rDNA 通用鉴定引物，引物序列为27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。利用细菌DNA 基因组提取试剂盒提取各分离菌DNA作为PCR 模板。PCR 产物由生工生物工程有限公司（上海）测序，利用NCBI 的BLAST 功能将测序结果与GenBank 数据库中的参考菌株进行比对分析。

1.5 分离菌的致病性试验将各分离菌置于37 ℃培养至对数期（OD600nm≈0.6）后备用。将上述各分离菌菌液以0.1 mL/只（浓度为1×107cfu/mL），经腹腔注射的方式感染小鼠，每株分离菌为1 个感染组，每组5 只小鼠，同时设1 组对照组，注射等量LB 液体培养基。观察并记录每组小鼠的状态，剖检死亡小鼠，并从其肝脏、肺脏、脾脏等器官再次分离细菌并鉴定。

1.6 分离菌的毒力基因检测以1.4 提取的各分离菌的DNA 作为模板。参考文献[6]中血清抗性蛋白iss基因、紧密黏附素intimin 基因、肠细胞脱落位点毒力岛（Locus of entericyte effacement，LEE）ler 和eaeA基因、耶尔森强毒力岛（High pathogenicity island，HPI）基因irp2和fyuA，空泡形成素vat基因、溶血素基因hlyF、热稳定性肠毒素astA、铁摄取系统iucD 和iroN、P 菌毛黏附素papC、外膜蛋白ompT 基因、I 型菌毛黏附素fimC基因共14种毒力基因引物序列合成引物，利用PCR检测分离菌的上述毒力基因。

1.7 分离菌的药物敏感性试验按照美国临床和试验室标准协会（CLSI）标准，采用KB 纸片法检测分离菌对氨苄西林、阿莫西林等15 种抗生素药物敏感性。按照CLSI 标准对试验结果进行判定。

1.8 分离菌的耐药基因检测以1.4 提取的各分离菌的DNA 作为PCR 模板，以参考文献[7]中的四环素类耐药基因tetA 和tetC，磺胺类耐药基因sul1 和sul3，喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、gyrA 和gyrB，β-内酰胺类耐药基因ctx-M 和SHV，氨基糖苷类耐药基因addA1、strA 和strB，大环内酯类耐药基因ermA 和mefA，共15 种耐药基因引物，利用PCR 方法检测各分离菌的耐药基因。上述各引物均由生工生物工程有限公司（上海）合成。

2 结 果

2.1 细菌的分离鉴定结果将水貂各脏器病料样品经鉴定培养基纯化培养，共得到24 株分离菌株，该24 株菌在伊红美蓝培养基形成的菌落呈金属光泽，细菌生化鉴定结果符合《伯杰氏细菌鉴定手册》中大肠杆菌的生化鉴定特性，16S rDNA 基因序列比对结果与GenBank 中的大肠杆菌参考菌株的基因序列同源在99%以上。以上结果表明分离菌为水貂源大肠杆菌，依次命名为DE-1～DE-20。

2.2 分离菌的致病性试验结果采用腹腔注射的方式将分离菌感染小鼠后24 h，小鼠精神沉郁、蜷缩、呼吸紊乱。连续观察一周，24个感染组小鼠均有不同程度死亡，死亡率在20%～100%（表1），对照组小鼠无任何临床症状，无死亡。剖检死亡小鼠，可见明显的败血症，肝脏、肺脏出血严重，腹腔有渗出液。分离病死小鼠肝脏、肺脏、脾脏等器官细菌，经鉴定为大肠杆菌，且各鉴定结果与感染菌株一致。表明分离菌株对小鼠具有一定的致病性。

2.3 分离菌的毒力基因检测结果利用PCR 技术对分离菌的毒力基因进行检测，结果显示，除DE-7 和DE-19 外，其余22 株分离菌均检测到毒力基因，且检出毒力基因数量不等（表1）。检测的毒力基因中，I 型菌毛黏附素fimC 基因检出率最高，为70.83%（17/24），未检出紧密黏附素基因intimin、LEE 毒力岛基因ler、P 菌毛黏附素papC 毒力基因（图1）。24 株大肠杆菌毒力基因携带种类较多，且不同菌株毒力基因携带情况不同，并且在总体水平上，携带毒力基因数越多的菌株致小鼠的死亡率越高，毒力基因检出数≥5 的菌株致小鼠全部死亡。表明分离菌株毒力基因携带较为复杂，并且毒力基因检出数越多的菌株毒力越强。

表1 24 株分离菌的毒力基因检测结果与小鼠死亡情况Table 1 Virulence gene and pathogenicity tests of the 24 isolates and death in mice

图1 24 株分离菌各毒力基因检出率Fig.1 Detection rate of virulence genes of the 24 isolates

2.4 分离菌的药敏试验结果采用KB 纸片检测24株大肠杆菌对15 种抗生素的敏感性。结果显示，24株大肠杆菌分别对5～13 种抗生素耐药（无耐3～4 种抗生素的分离菌），多重耐药菌株占比高达100%（24/24）（图2），对替米考星、土霉素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、复方新诺明耐药菌占80%以上，对头孢曲松的敏感性最高，敏感菌株占66.67%（16/24）（表2）。结果表明，24 株大肠杆菌具有高度多重耐药性，且不同菌株的耐药表型有一定差别，临床用药时应具体分析致病菌对抗生素的敏感性，合理用药，避免耐药性菌株的产生。

图2 24 株分离菌多重耐药统计结果Fig.2 Statistics of multidrug resistance of the 24 isolates

表2 24 株分离菌的药敏试验结果Table 2 Results of drug susceptibility test of 24 isolates

2.5 分离菌耐药基因检测结果利用PCR 检测分离菌的耐药基因。结果显示，24株分离菌分别检出了1～7种耐药基因，其中氨基糖苷类耐药基因addA1、喹诺酮类耐药基因gyrA 和gyrB 检出率较高，为70.83%～79.17%，未检出四环素类耐药基因tetA 和tetC、磺胺类耐药基因sul1、大环内酯类耐药基因mefA（图3）。分离菌的耐药基因携带种类及个数有一定的差异。β-内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类的耐药表型与耐药基因基本相符，四环素类、大环内酯类和磺胺类这3 类耐药基因与其耐药表型基本不符，表明分离的大肠杆菌可能存在多种耐药机制。

图3 24 株分离菌各耐药基因的检出率结果Fig.3 Detection rate of drug resistance genes in the 24 isolates

3 讨 论

致病性大肠杆菌是一种重要的人畜共患病病原，人和动物感染该菌后可表现出多种类型的临床症状[8]。致病大肠杆菌感染水貂发病且具死亡率较高，康复后的动物生产性能降低，给水貂养殖行业造成严重的经济损失。为了解河北地区水貂源大肠杆菌的致病性与耐药性，本研究以小鼠为动物模型进行致病性试验，结果显示，24 组感染组小鼠均有不同程度的死亡，且不同菌株致小鼠死亡情况不同，表明24 株分离菌对小鼠均具有致病性，但致病性有一定的差别。在夏琦琦[9]等人的研究中，水貂源大肠杆菌致病菌株占比较高，表明大肠杆菌是致水貂发病的重要病原。

本研究的24 株大肠杆菌均分离自水貂肝脏、脾脏、肺脏等肠道外组织，属于肠外致病性大肠杆菌（Extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC）。在大肠杆菌的致病过程中，某些毒力因子起着重要的作用[10]。ExPEC 毒力因子主要包括黏附因子、免疫相关毒力因子和代谢相关毒力因子[11]。PCR 检测结果显示，iss、irp2、fyuA、Vat、hlyF、astA、iucD、eaeA、iroN、ompT、fimC 等毒力基因在24 株ExPEC均有不同程度的检出，而未检出紧密黏附素基因intimin、LEE 毒力岛基因ler、P 菌毛粘附素基因papC。其中I 型菌毛黏附素的fimC 基因检出率最高，为70.83%（17/24）。fimC 基因在禽源高致病性大肠杆菌中检出率较高，并有研究报道利用基因敲除技术敲除fimC 基因后大肠杆菌的毒力下降[12]。fimC基因在毛皮动物致病大肠杆菌的相关报道较少，本研究中该基因检出率较高，表明fimC 基因可能与水貂致病大肠杆菌的致病性有关；24 株ExPEC 的irp2毒力基因检出率仅次于fimC。在本研究中和张海威研究中，ExPEC 的irp2 毒力基因检出率均较高[9]，而夏琦琦报道的水貂源肠道致病性大肠杆菌中该基因检出率较低[9]，irp2 毒力基因在ExPEC 的检出率要高于肠道分离的大肠杆菌，表明该基因在肠内和肠外致病性大肠杆菌的携带情况不同，并可能与ExPEC的致病性有关。此外，在本研究中携带多种毒力基因的大肠杆菌致病力较强，表现为携带5 种以上毒力基因的菌株感染的小鼠全部死亡，而毒力基因数均小于5 的菌株感染的小鼠未全部死亡，但该大肠杆菌毒力基因个数与其致病性的相关性还需增加实验动物数量等，通过生物学统计来评估该相关性。

近年来，细菌对抗生素耐药问题得到社会的广泛关注，对致病菌的耐药性检测具有重要的现实意义。本研究中24 株水貂大肠杆菌均表现出多重耐药性，其中对替米考星、土霉素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、复方新诺明表现为高度耐药，但对头孢曲松的敏感度最高。据报道，水貂致病性大肠杆菌多重耐药问题普遍存在，并且时间、地区、饲养方式等条件不同，大肠杆菌的耐药表型存在一定的差异[13-14]。水貂大肠杆菌耐药性的产生很大程度上与养殖过程中长期不合理利用抗生素药物密切相关，因此，建议临床用药时应先进行致病菌的药物敏感性试验，选取效果较好的药物治疗，以缓解细菌对抗生素药物的选择压力同时还可以减少经济损失。

大肠杆菌的耐药性可分为天然耐药性、自身基因突变耐药性和获得性耐药性，耐药基因在大肠杆菌耐药性产生、传播以及遗传中起着十分重要的作用[15]。本研究的24 株大肠杆菌携带不同数量耐药基因，其中氨基糖苷类耐药基因addA1、喹诺酮耐药基因gyrA、gyrB 检出率较高。addA1 编码的蛋白是氨基糖苷类转移酶的重要组成部分，该酶可以钝化修饰氨基糖苷类药物的结构，从而使大肠杆菌对氨基糖苷类药物耐药[16]。gyrA、gyrB 基因分别编码DNA 回旋酶的2 个A 亚基和B 亚基，是大肠杆菌对喹诺酮类药物产生耐药性的重要基因[17]。河北地区水貂源大肠杆菌的addA1、gyrA、gyrB 3 种耐药基因检出率较高，表明这3 种耐药基因在河北地区水貂源大肠杆菌中较为流行，临床用药时应注意，河北地区水貂源大肠杆菌对氨基糖苷类与喹诺酮类药物具有较高的潜在耐药性。本研究中，分离菌株对四环素类、大环内酯类和磺胺类抗生素药物的耐药表型与耐药基因检出率符合率较低，这与其它研究结果相符[18-19]。分析原因，可能是由于细菌耐药性的产生是由多个耐药基因、多重耐药机制协同作用的结果[8]。致病性大肠杆菌耐药基因检测是了解细菌耐药性以及对细菌耐药性危害评估的方法之一，其不仅解释了细菌耐药性产生的原因，还可预估细菌的潜在耐药性，防止耐药基因在不同的致病菌中的传播，减少对其它动物和人类健康造成威胁。

本研究对24 株河北地区水貂源大肠杆菌的致病性和耐药性进行了研究，结果显示24 株大肠杆菌均具有致病力和多重耐药性，其所携带的毒力基因和耐药基因较复杂。本研究为河北地区水貂大肠杆菌病的防治提供参考依据，为水貂ExPEC 的致病及耐药机理的研究奠定了实验基础。