兔百草枯中毒CT肺纹理特征与肾灌注的相关性研究

翟乾 苏云杉 岳梨蓉 毛崇文 尤梦晶 向述天

百草枯（paraquat，PQ）是一种除草剂，对人畜均具有极强的毒性，目前尚无特效治疗方法。PQ中毒病人常表现为多器官功能损伤，以肺、肾和肝损伤最常见，终因呼吸衰竭、肾功能衰竭而死亡。目前，对PQ中毒多器官损伤已有大量研究，而多脏器损伤程度之间是否存在关联则鲜见报道。因此，如果能通过无创性影像检查对肾、肺等重要脏器的损伤情况做出监测及相关性评估，或许能为疾病的治疗及预后提供指导。纹理分析（texture analysis,TA）作为影像组学的重要组成部分，可通过提取医学图像的纹理特征，进而对肿瘤异质性进行量化评估。TA不仅能应用于肺部肿瘤性疾病，也可对PQ中毒后肺损伤与肺炎进行鉴别[1]，这为区分生物性和化学性肺损伤提供了新思路。因此，本研究通过建立兔PQ中毒多器官损伤模型，并尝试采用肺CT纹理特征参数、肾CT灌注参数[肾血流量（renal blood flow，RBF）]分别量化评估肺、肾损伤，旨在探讨PQ中毒后肺、肾损伤的相关性。

1 材料与方法

1.1 动物模型 健康6月龄日本大耳白兔24只，体质量2.5～3.0 kg，雌雄不限，由昆明医科大学动物实验中心提供[实验动物使用许可证：SCXK（滇）2011-0004]。24只兔随机分为PQ组及对照组，每组各12只。在18～25℃实验室适应性饲养7 d后建模，期间自由进食、饮水，建模前禁食禁水12 h后空腹称体质量。经兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1 mL/kg体质量）麻醉后对兔行胃插管处理。PQ组兔以百草枯溶液（质量分数为20%，东农药化工有限公司生产）灌胃，剂量为35 mg/kg体质量；对照组以等量生理盐水灌胃，记录灌药时间。建模时或实验期间若兔因意外原因死亡则及时进行增补，按照死亡兔组别并依照增补兔体质量重新灌胃，随后在相应时间节点对增补兔按实验要求进行处理。本研究通过了昆明医科大学实验动物管理委员会审查。

1.2 样本采集及观察 参照既往文献[2-4]设计本研究的时间点。2组兔灌胃后于2 h、24 h、7 d、14 d共4个时间点分别对每只兔行胸部平扫及双肾灌注成像，由2名工作5年以上的放射科主治医师对肾灌注图像进行后处理并观察肺损伤后影像改变（磨玻璃影、肺实变、间质纤维化、胸腔积液及气胸等）。同时于上述时间点每组随机处死2只兔，常规取肺、肾组织行HE染色后由2名工作15年以上病理科副主任医师对组织切片进行病理学观察。主要观察肾皮质区肾小管破坏情况、肺组织炎症浸润、肺间质改变以及肺、肾病理改变是否可逆。当影像结果或病理结果存在分歧时，则分别由放射科或病理科的2名医生商讨确定。若某时间点PQ组处死的2只兔病理结果不一致，则由上述放射科及病理科医师共同讨论后，取损伤改变较重者作为最终结果。

1.3 扫描设备及参数 采用东芝Aquilion ONE 320排动态容积CT扫描设备，将兔麻醉后取俯卧、足先进体位固定于扫描床，先对兔行胸部CT容积扫描（平扫），扫描参数：管电压100 kV，管电流200 mA，旋转时间0.35 s/r，视野 （FOV）180 mm×180 mm或240 mm×240 mm，矩阵512×512，准直器宽度320×0.5 mm，采用软组织函数 （Fc17）及高分辨函数（Fc56）各重建一组容积数据，重建层厚为0.5 mm，层间距为0.25 mm。随后进行双肾灌注功能成像扫描，首先行兔双肾定位扫描，扫描野包括双肾上下极，随后行灌注扫描，扫描参数：管电压80 kV，管电流150 mA，球管旋转时间、FOV、采集矩阵、准直器宽度及重建层厚、层间距均同胸部CT平扫，采用软组织函数（Fc17）重建。于灌注扫描开始时采用高压注射器经兔耳缘静脉注入3 mL非离子型对比剂碘帕醇(含碘370 mg/mL,上海博莱科信谊药业有限责任公司，批号：1907007F），注射流率 0.5 mL/s，间隔时间2.2 s，在66 s内完成灌注成像扫描。

1.4 肾灌注数据采集 扫描完成后将容积数据传输至Vitrea fx（Vision 6.5.8）工作站，选择肾脏灌注软件 Body Perfusion CT（4D Single Input Perfusion）进行灌注分析。将RBF灌注伪彩图层厚调整为1 mm，由2名放射科医师分别以兔单侧肾脏的肾动脉水平为基准线（含该层面），在RBF横断面伪彩图上沿头尾方向连续选择上、下各7个层面，在每层肾皮质区域随机勾画2个2 mm2大小的圆形兴趣区（ROI），每侧肾脏均选取30个ROI测量每个ROI的RBF值，最后取2名医师测量的平均值。测量RBF值时注意避开血管。

1.5 肺CT纹理特征提取 扫描获得肺容积数据，重建层厚、层间距均为5 mm的图像，并以DICOM格式保存，将重建图像导入MaZda 4.6纹理分析软件（http://www.eletel.p.lodz.pl/programy/mazda/），由上述2名放射科医师分别独立手动勾画双肺各层图像的二维ROI一次，将分割出的双肺二维ROI融合后重建出三维ROI，并同时获取TA数据，最终取两者的测量平均值作为最终结果。选择3类15个肺CT纹理特征，分别为形状特征，即体积；直方图特征，包括方差、均值、偏度、峰度、第1百分位数（Perc.1%）、第 10百分位数（Perc.10%）、第 50百分位数（Perc.50%）、第 90百分位数（Perc.90%）和第99百分位数（Perc.99%）；游程矩阵特征，包括游程长不均匀度、灰度不均匀度、长游程增强、短游程增强、行程比。

1.6 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件对数据进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示。满足球形检验的肺CT纹理特征值及肾灌注参数RBF值在不同时间点间的比较采用重复测量方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。采用Pearson相关分析肺CT纹理特征与RBF值的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理变化 ①肾：光镜下观察显示对照组肾皮髓质结构及形态无异常；PQ组2 h~14 d肾皮质结构出现受损改变并随时间延长呈逐渐加重趋势且不可逆（图1）。②肺：光镜下观察显示对照组支气管及肺泡结构未见明显异常；PQ组灌药后2 h~14 d肺组织出现损伤改变并随时间延长呈加重趋势且不可逆（图 2）。

图1 对照组与PQ组肾组织病理结果（HE，×400）。对照组肾组织结构正常（A）。PQ组2 h见肾小囊腔内少量嗜酸性物质（B，细箭）；24 h见肾小管上皮细胞胞质空泡化，核固缩深染（C，细箭），局部肾小管扩张（D，细箭）；7 d部分扩张肾小管可见蛋白管型（D，粗箭），局部可见脱落的上皮细胞溶解（E，细箭）。

2.2 2组兔各时间点肺部CT影像 各时间点对照组兔双肺纹理均清晰，双侧肺野均无明显渗出及实性改变（图3A）。PQ组于灌药2 h后12只兔中有10只（83.3%）肺内未见异常，2只（16.7%）肺内见少许浅淡磨玻璃影 （图3B）；24 h后剩余的10只兔肺内均可见不同程度肺纹理增粗、紊乱，其中7只（70%）见肺内片状磨玻璃影、支气管血管束增粗伴支气管扩张、扭曲 （图3C）；7 d后剩余的8只兔中有7只（87.5%）肺内见局部实变影并伴空气支气管征（图3D）；14 d后剩余的6只兔肺实变情况均较7 d时加重，其中4只兔（66.7%）在上述基础上可见纵隔旁及侧胸壁下气胸形成（图3E）。

2.3 PQ组的肺CT纹理特征及肾灌注参数不同时间点间的比较 各时间点间均值、Perc.50%、体积、灰度不均匀度、长游程增强、短游程增强、行程比及RBF值的差异均有统计学意义（均P<0.05）；其余纹理特征参数各时间点的差异无统计学意义（均P>0.05）。各参数不同时间点间两两比较，均值在14 d时分别高于24 h、7 d；Perc.50%在14 d时高于24 h；体积和灰度不均匀度在14 d时分别低于2 h、24 h、7 d；长游程增强、短游程增强在14 d时分别高于2 h、24 h；行程比在14 d时高于7 d；RBF在7 d时低于 24 h，在 14 d 时分别低于 2 h、24 h（均 P<0.05）；其余参数各时间点间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。体积、灰度不均匀度、长游程增强及RBF随时间延长呈逐渐减小趋势，均值、Perc.50%、短游程增强及行程比随时间延长呈逐渐增大趋势。详见表1。

2.4 PQ组肾灌注参数与肺CT纹理特征的相关性 PQ组RBF与体积、灰度不均匀度、长游程增强呈 线 性 正 相 关 （r=0.972、0.963、0.981，P=0.028、0.037、0.019），与均值、Perc.1%、Perc.10%、Perc.50%、短游程增强及行程比呈线性负相关（r=-0.981、-0.977、-0.989、-0.988、-0.970、-0.967，P=0.019、0.023、0.011、0.012、0.030、0.033）；而与方差、偏度、峰度、Perc.90%、Perc.99%及游程长不均匀度无相关性（r=0.768、0.827、0.502、-0.656、-0.001、0.947，P=0.232、0.173、0.498、0.344、0.999、0.053）。

3 讨论

PQ中毒为全身多器官受累，其中急性肺损伤是PQ中毒后最突出和最严重的改变，晚期可发展为肺间质纤维化，最终导致呼吸衰竭，是PQ中毒致死的主要原因[5]。肾脏作为PQ中毒的主要靶器官，也是毒物排泄的主要器官[6]。PQ导致急性肾损伤可造成毒物排泄障碍，加剧病情恶化[7]。因此，采取有效检查手段尽早评估肾、肺损伤状况十分关键。

图2 对照组与PQ组肺组织病理结果（HE，×400）。对照组肺组织结构正常（A）。PQ组灌药后2 h见血管周围炎性细胞浸润（B，细箭）及肺泡壁断裂（B，粗箭）；24 h见支气管上皮细胞胞质空泡化（C，细箭），局部组织出血合并肺泡腔内大量红细胞（C，粗箭），局部较多肺泡壁增厚伴炎性细胞浸润，肺泡腔内见嗜酸性浆液样物质渗出（D，粗箭）；7 d见局部支气管上皮脱落（E，细箭），组织中大面积毛细血管淤血扩张（E，粗箭）。

图3 2组兔肺部CT影像。A图，对照组；B-E图分别为PQ组灌药后2 h、24 h、7 d、14 d的肺部影像表现。

表1 PQ组不同时间点肺部CT纹理特征参数及肾灌注参数比较

3.1 RBF对肾损伤的评估 以往临床常以血生化指标血清肌酐 （serum creatinine，Scr）、 血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）值变化为参考对肾功能损伤进行评估，但 Ralib等[8]研究发现，Scr、BUN 并不能准确反映早期肾功能损伤，也无法评估肾功能损伤的晚期改变。万等[3]研究发现容积CT肾脏灌注功能成像可对兔PQ中毒肾损伤进行早期量化评估，且肾脏灌注参数肾血容量及RBF可较Scr、BUN能更早提示肾组织损伤的程度。Hueper等[9]采用7 T MR评价大鼠肾缺血后灌注情况，结果显示动脉自旋标记技术可无创监测急性肾损伤，肾皮质RBF可以量化评估急性肾功能改变。以上研究表明，RBF作为肾脏灌注指标可有效评估急性肾损伤。本研究结果显示，PQ组兔灌药后RBF值从早期开始随时间延长呈逐渐减小趋势，这是由于PQ中毒后肾功能受损，而PQ主要损伤肾小管，可造成肾小管上皮细胞损伤、管腔狭窄甚至闭塞，从而导致肾皮质血流量下降，该结果同万等[3]和Hueper等[9]研究结果一致。

3.2 CT纹理分析对肺损伤的评估 多层螺旋CT是PQ中毒后肺损伤状况评估最常用的影像手段，但其早期诊断价值有限。Song等[2]研究发现容积CT肺灌注功能成像可对PQ中毒致肺损伤后血流动力学改变进行超早期评估及动态监测。但CT灌注成像存在的一些缺点将限制其在肾、肺的广泛应用，如对比剂过敏、肾损伤加重[10]以及辐射剂量增加等。因此，本研究尝试采用TA技术从无需对比剂的CT平扫影像中提取纹理特征来量化评估肺损伤，以满足临床实际需求。

TA是一种通过医学影像的灰度级和/或像素强度直方图研究病变组织异质性的图像后处理技术，可对人眼观察不到的变化引起的图像异质性进行量化[11]。同传统影像诊断相比，TA可通过自动或半自动TA软件从医学图像中提取不同种类的纹理特征，并对客观数据进行量化分析，可以比影像医生的主观判读提供更丰富的信息[12]。目前，TA的研究多集中于肿瘤影像组学，而对非肿瘤病变研究报道相对较少。近年已有文献[13-15]报道TA在阻塞性肺疾病、系统性硬化肺部病变及放射性肺炎等肺部非肿瘤性疾病的相关研究，这表明TA对于肺部非肿瘤病变同样具有较大的潜在价值。但是，TA的应用研究现尚处于起步阶段，各纹理特征所代表的含义并未完全阐明，仅少部分特征具有可解释性。

本研究结果显示：①肺纹理形状特征即体积值随时间延长呈逐渐减小趋势，这可能是因为肺损伤过程中肺泡壁发生断裂，肺泡壁炎症细胞浸润致肺渗出增多，肺泡出现萎缩、塌陷最终导致肺不张，肺容积将逐渐缩小，这与本研究中兔肺CT影像上正常的肺组织损伤后最终发展为肺实变、纵隔及胸膜下气肿等表现基本一致。②直方图特征反映病变特征值的离散程度，其值越大则异质性越强[16]。其中，均值描述ROI内肺纹理的规则程度，其值越大，反映肺纹理越杂乱无章[17]。本研究中均值随时间延长呈逐渐增大趋势，这在病理上表现为肺损伤早期出现炎性渗出，进而正常含气肺泡由嗜酸性物质及大量红细胞充填而发生实变并逐渐演变为肺间质纤维化，该过程中肺组织由排列规则的含气组织转变成为杂乱无章的实变组织，以上表现同兔肺CT影像所见一致。百分位数描述为低于某一百分位数所测量像素的百分比，可在一定程度上反映病变的异质性，但目前百分位数的具体含义仍尚未明确[18]。本研究中Perc.50%随时间延长呈逐渐增大趋势，提示Perc.50%可为量化评估肺损伤提供参考。③游程矩阵特征系在规定方向上某灰度值的像素累计出现的频数[19]，可反映图像纹理的规则程度。其中，灰度不均匀度反映图像中灰度的相似程度，图像灰度不均匀度越小，表示图像灰度越均匀，即纹理表现越规则；长游程增强越大，图像纹理越不规则；而短游程增强越大，图像纹理越细；行程比越大，图像纹理越杂乱[20]。本研究中行程比随时间延长呈逐渐增大趋势，可反映肺损伤后ROI内肺纹理的变化趋势，这与兔肺CT影像表现和病理改变一致。而灰度不均匀度、长游程增强及短游程增强3个纹理特征随时间延长的变化趋势所反映的生物学含义与既往研究结果[20-21]相悖，这可能是由于肺为含气脏器，其空间结构与实性组织差异较大，目前影像组学的研究对象主要为肿瘤或非肿瘤的实性病变，而对肺部非肿瘤非实性病变研究较少，许多机制尚难以解释，因此以实性病变的结论作为PQ肺损伤的参考可能并不合理。同时，在本研究中，PQ组兔灌药后2 h胸部CT尚未出现较显著影像改变，而部分CT纹理特征值已经发生变化，这表明肺CT纹理特征改变早于影像改变，提示其可用于肺损伤早期量化评估。

3.3 PQ中毒后肾、肺损伤的相关性 本研究发现PQ中毒后RBF与肺CT纹理特征体积、灰度不均匀度、长游程增强呈线性正相关，而与均值、Perc.1%、Perc.10%、Perc.50%、短游程增强及行程比呈线性负相关，这可能是由于肾脏是PQ排泄的主要器官，PQ中毒后急性肾损伤导致肾灌注减低，从而造成PQ从体内排出减缓，血浆内持续的高浓度PQ将加重肺损伤，而肺损伤后肺血流灌注减低及肺渗出实变、间质纤维化等病变可引起肺功能异常，这将加剧PQ在肺内滞留，当其在肺内浓度达到峰值后可再释放入血液，从而形成恶性循环[22]。因此，本研究表明PQ中毒后的多器官损伤中肺、肾损伤的发生及演变存在关联，在临床上有望采用常规CT胸部扫描并应用TA技术，通过肺CT纹理特征变化对肺、肾损伤程度进行评估及预测，而不需要采取CT灌注成像。

3.4 局限性 ①由于样本量较少可能会存在偏倚，这也是部分参数在各时间点比较时其差异无统计学意义的主要原因之一；②肺部非肿瘤病变TA研究的相关报道极少，可供参考资料有限；③ROI采用手动勾画，可重复性差，影响结果的准确性。

3.5 小结 基于肺部非肿瘤影像的TA是一项可行的技术，其与肾灌注功能成像可分别应用于PQ中毒后肺、肾损伤的早期量化评估。PQ中毒后肺、肾损伤存在关联性，部分肺CT纹理特征参数可作为PQ中毒肺损伤的影像标志物，有望用于PQ中毒后多器官损伤的量化评估。