质谱技术直接鉴定报阳血培养细菌可行性分析

王军杰，马 冰，李 轶，闫文娟，王山梅，马 琼，张江峰，许俊红，袁有华

（1. 周口市鹿邑真源医院检验科，河南 周口 477200；2.河南省人民医院检验科，河南 郑州 450003）

血流感染（bloodstream infection，BSI）发展迅速、病死率高，是医院最危重的感染之一[1]。血培养是BSI诊断的金标准。对于报阳的血培养，传统的实验室报告流程包括革兰染色镜检、传代分离培养、基于表型的生化鉴定和抗菌药物体外药物敏感性试验等步骤，出具报告需要48～72 h，且每延迟1 h均可能增加患者的病死率。如果病原菌生长条件要求苛刻或生化惰性，则周期更长。因此，对血培养报阳样本的病原菌进行快速、准确的鉴定显得尤为重要[2]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）无需进行常规的革兰染色、氧化酶、触酶和生化反应，数分钟内就可完成鉴定比对，操作简便、快速、通量高、成本低，是临床微生物检验革命性的发展。本研究拟采用MALDI-TOF MS直接对血培养阳性样本进行菌种鉴定，并同步进行传统细菌培养常规生化鉴定，比较2种方法结果的一致性，评估质谱技术在BSI诊断中的价值。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集2018年7—9月河南省人民医院临床送检的非重复报阳血培养443瓶。入选标准：全自动血培养系统发出阳性报警，经常规涂片革兰染色镜检确认。排除标准：报阳培养物常规革兰染色镜检结果为无细菌。同一患者同时或先后送检多瓶血培养，取最先报阳的血培养，以避免重复。

1.2 仪器与试剂

BACTEC FX血培养系统、需氧和厌氧血培养瓶、Phoenix 100全自动微生物分析系统及药物敏感性试验板条（美国BD公司），Microflex LT/SH全自动快速生物质谱检测系统、MSP96孔靶板和α-氰基-4-羟基肉桂酸（德国Bruker Daltonik公司），甲酸与乙腈（美国Sigma-Aldrich公司），血平板、麦康凯平板和巧克力平板（郑州安图公司）。

1.3 常规生化鉴定

将阳性培养物同时转种于血平板、巧克力平板和麦康凯平板，获得纯菌落后采用Phoenix 100全自动生化鉴定药敏系统进行细菌鉴定与体外药物敏感性试验，结果依据美国临床实验室标准化协会2018年相关标准进行判定。

1.4 质谱法鉴定

1.4.1 质谱前处理 本研究团队通过预实验比较了几种不同的样本处理方法，优化改良后制定了本实验的标准操作流程。从报阳血培养瓶中取出3.0 mL血液转入3.5 mL血浆分离胶管，1 600×g离心10 min。弃上清，加1.0 mL去离子水重悬沉淀，转入1.5 mL Eppendorf离心管中，12 000×g离心3 min，弃去上层的水和细胞。再次重悬沉淀于1 mL去离子水，12 000×g离心3 min，再次弃去上层的水和细胞，小心吸除上层液体保留白色菌膜。取1 μL用于质谱分析。

1.4.2 质谱分析 取1 μL样本提取物点样于96孔不锈钢质谱靶板，待干燥后再覆以1 μL 70%甲酸自然晾干。待干燥后再覆以1 μL基质液（α-氰基-4-羟基肉桂酸）自然晾干。完全干燥后，将靶板放入Microflex LT/SH全自动快速生物质谱检测系统进行鉴定，输入菌株信息，采集菌株质谱数据，利用Biotype 3.0软件将人工采集到的图谱与数据库中的图谱进行比对和结果分析，鉴定菌种，记录质谱评分前2种非重复菌种的鉴定结果。分值≥2.000，判定为能有效鉴定至种水平；分值为1.700～2.000，判定为可有效鉴定至属水平；分值<1.700，判定为鉴定结果不可靠。

1.5 统计学方法

采用FlexControl 3.0软件、Biotype 3.0软件、ChinProTool 3.0软件（德国Bruker公司）进行数据分析。

2 结果

2.1 病原菌分布

排除7个假报阳血培养瓶，阳性培养物中共分离出436株细菌，其中革兰阳性菌155株（35.6%）、革兰阴性菌236株（54.1%）、真菌19株（4.4%）、厌氧菌12株（2.7%）、少见菌14株（3.2%），所有样本均采用Microflex LT/SH全自动快速生物质谱检测系统进行鉴定。155株革兰阳性菌中，有147株（94.8%）质谱鉴定可信度分值≥1.700，115株（74.2%）鉴定可信度分值≥2.000。236株革兰阴性菌中，有226株（95.8%）质谱鉴定可信度分值≥1.700，173株（73.3%）鉴定可信度分值≥2.000。19株真菌中，有16株（84.2%）质谱鉴定可信度分值≥1.700，5株（26.3%）鉴定可信度分值≥2.000。12株厌氧菌中，有9株（75.0%）质谱鉴定可信度分值≥1.700，8株（66.7%）鉴定可信度分值≥2.000。14株少见菌中，有13株（92.9%）质谱鉴定可信度分值≥1.700，7株（50.0%）鉴定可信度分值≥2.000。

2.2 革兰阳性菌鉴定结果

155株革兰阳性菌中，有127株（81.9%）2种方法鉴定结果一致。82.5%（85/103）的葡萄球菌属鉴定结果一致，其中98株可信度分值≥1.700，鉴定一致率达100%；78株可信度分值≥2.000，鉴定一致率达85.9%（67/78）。66.7%（14/21）的链球菌属2种方法鉴定结果一致，其中19株可信度分值≥1.700，鉴定一致率达84.2%（16/19）；14株可信度分值≥2.000，鉴定一致率达85.7%（12/14）。95.8%（23/24）的肠球菌属鉴定结果一致，其中24株可信度分值≥1.700，鉴定一致率达100%；19株可信度分值≥2.000，鉴定一致率达94.7%（18/19）。71.4%（5/7）的阳性杆菌鉴定结果一致，其中6株可信度分值≥1.700，鉴定一致率达71.4%（5/6）；4株可信度分值≥2.000，鉴定一致率达100%。见表1。

表1 革兰阳性菌2种方法鉴定结果比较

2.3 革兰阴性菌鉴定结果

236株革兰阴性菌中，有219株（92.8%）2种方法鉴定结果一致。93.2%（178/191）的肠杆菌科细菌鉴定结果一致，其中182株可信度分值≥1.700，鉴定一致率为98.4%（179/182）；140株可信度分值≥2.000，鉴定一致率为95.7%（134/140）。90.5%（38/42）的非发酵菌鉴定结果一致，其中41株可信度分值≥1.700，鉴定一致率达97.6%（40/41）；30株可信度分值≥2.000，鉴定一致率达93.3%（28/30）。3株其他革兰阴性杆菌鉴定结果一致率达100%；见表2。

2.4 真菌鉴定结果

19株真菌中，有16株（84.2%）2种方法鉴定结果一致。其中16株可信度分值≥1.700，鉴定一致率达93.8%（15/16）；5株可信度分值≥2.000，鉴定一致率达80.0%（4/5）。见表3。

2.5 厌氧菌和少见菌鉴定结果

12株厌氧菌中，有8株（66.7%）2种方法鉴定结果一致；其中9株可信度分值≥1.700，鉴定一致率达77.8%（7/9）；8株可信度分值≥2.000，鉴定一致率达87.5%（7/8）。14株少见菌中，有8株（57.1%）2种方法鉴定结果一致；其中13株可信度分值≥1.700，鉴定一致率达76.9%（10/13），7株可信度分值≥2.000，鉴定一致率达85.7%（6/7）。见表4、表5。

表2 革兰阴性菌2种方法鉴定结果比较

表3 真菌2种方法鉴定结果比较

表4 厌氧菌2种方法鉴定结果比较

表5 少见菌2种方法鉴定结果比较

3 讨论

质谱技术作为近些年发展起来的新技术，与传统表型鉴定法相比，最大的优势在于可直接鉴定血培养瓶中的细菌，从而节约再次分离培养鉴定的时间。本研究结果表明，质谱技术鉴定细菌可信度分值≥2.000的细菌以革兰阳性菌（74.2%）最多，以下依次是革兰阴性菌（73.3%）、厌氧菌（66.7%）、少见菌（50.0%）、真菌（26.3%），且2种方法鉴定结果一致率也以革兰阴性菌（92.8%）最高，以下依次为革兰阳性菌（81.9%）、真菌（84.2%）、厌氧菌（66.7%）、少见菌（57.1%），与文献报道结果（质谱对革兰阴性菌鉴定准确率高于革兰阳性菌）[3]一致。在常见阳性菌，如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、纹带棒状杆菌，尤其是屎肠球菌和粪肠球菌，以及常见阴性菌如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等的鉴定中，质谱技术的准确率很高[4]。本研究发现，在真菌（近平滑念珠菌、光滑念珠菌等）、厌氧菌（脆弱拟杆菌等）及少见菌（藤黄微球菌等）的鉴定中，质谱技术与常规鉴定方法的结果有非常高的一致性。质谱技术鉴定链球菌属准确率较低可能与缓症链球菌不同种之间的相似性较高（如缓症链球菌、血链球菌和口腔链球菌）[5]有关。葡萄球菌属主要是区分金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌，质谱技术对二者的鉴别诊断较为准确。从阳性血培养瓶中快速、准确地鉴定细菌是质谱技术的最大优势。本研究在2 h内就能从阳性血培养瓶中得到种、属水平的鉴定报告，对于BSI，尤其是重症BSI患者来说意义重大。因此，在BSI诊疗中采用质谱技术，结合医院和地区的耐药性检测数据，可合理选择抗感染治疗方案，即能覆盖可能的病原体，又可避免广谱抗菌药物的过度使用。

本研究仍存在不足之处，如由于样本数量的原因，有些细菌仅有1次鉴定结果，可能无法得出准确的结论，但本研究结果支持质谱技术可直接准确、快速地鉴定阳性血培养瓶中的细菌这一结论。虽然样本处理流程、血培养瓶类型、常见菌种分布差异等可能导致不同研究中结果的差异[6]，但采用质谱技术可满足临床对BSI常见病原菌快速诊断的需求，可帮助临床早期进行合理的抗菌药物治疗，提高BSI患者的生存率，值得推广。