高危型HPV E7蛋白在宫颈鳞状上皮内病变中的表达及意义

乔 娟 虞红珍 吴 强

宫颈癌是世界上女性最常见的恶性肿瘤之一。高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)持续感染是引起宫颈上皮内病变及宫颈癌的主要原因。病毒癌基因E7表达编码E7蛋白(E7)通过其结合和灭活视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，Rb)的能力来刺激细胞生长周期失控，导致宫颈癌的发生[1，2]。HR-HPV E7癌基因活性可通过检测E7 mRNA或蛋白或间接检测宿主P16蛋白的表达来监测，而P16的表达受HR-HPV E7及其上调的影响[3，4]。研究表明P16/Ki-67的表达是鉴别HSIL的有效标志物[5～7]。虽然P16/Ki-67辅助诊断LSIL及HSIL已广泛应用于临床，但是仍有一部分病例难以诊断，尤其是CINⅡ的病例，P16/Ki-67的染色仍然难以鉴别LSIL及HSIL[8]。近年来研究发现，E7对宫颈癌的早期诊断有较高潜在价值，但尚未应用于临床诊断[9]。本研究利用宫颈液基细胞学剩余标本制成细胞蜡块，采用免疫组化方法检测宫颈细胞蜡块及相对应组织蜡块中E7、P16及Ki-67的表达，探讨E7对宫颈鳞状上皮内病变的辅助诊断价值。

资料与方法

1.一般资料：71例宫颈标本来源于2018年7月～2019年6月在安徽医科大学第二附属医院病理科行宫颈液基细胞学检查并行宫颈组织学病理检查的患者，患者年龄20～68岁，中位年龄45岁。所有病例均无宫颈上皮内病变(CIN)史、宫颈癌史且均未接受过放、化疗，无子宫全切术史，目前无妊娠，检查前3天内无阴道冲洗及用药史。根据2014年TBS宫颈细胞学报告系统进行细胞学诊断并分组：未见上皮内病变或细胞(negative for intraepithelial lesion or malignacy, NILM)11例，非典型鳞状细胞-不能明确意义(atypical squamous cells of undetermined significance, ASC-US)12例，低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)22例，非典型鳞状细胞-不除外高度上皮内病变(atypical squamsus cells cannot exclude HSIL, ASC-H)2例，高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)20例，鳞状细胞癌(squamous cells cancer, SCC)4例。组织学诊断标准参考《WHO分类女性生殖器官肿瘤》(第4版)，诊断结果包括黏膜慢性炎(NILM)、LSIL、HSIL及SCC(LSIL包括CINⅠ，HSIL包括CINⅡ、CINⅢ和原位癌)[10]。其中NILM、LSIL、HSIL及SCC的病例均选取细胞学与组织学诊断结果一致的病例，细胞学诊断为ASC-US及ASC-H的病例，组织学诊断结果详见表1。

表1 71例宫颈细胞学诊断结果与组织学的对照

2.主要试剂：P16鼠抗人单克隆抗体(AbM51100-10)、Ki-67兔抗人单克隆抗体(SP6)购自广州安必平医药科技股份有限公司，二抗(通用型试剂盒PV-6000)、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，HPV E7兔抗人单克隆抗体(AT-RMA034和AT-RMA139)购自苏州艾托金生物有限公司。

3.细胞蜡块制备：将宫颈液基细胞保存液瓶中的剩余液体收集在离心管中，以2500r/min离心5min，弃上清；加入95%乙醇混匀，以2500r/min离心5min，固定30min，弃上清；可见成团的细胞沉渣，用包埋纸包好，常规脱水、石蜡包埋。

4.免疫组化染色：组织及细胞蜡块4μm厚连续切片，免疫组化步骤如下：①放入65℃烤箱烤片2h，常规二甲苯、梯度乙醇脱蜡、水化；②柠檬酸钠缓冲液高压抗原修复切片，室温下冷却20min，自来水小水冲淋使之冷却至室温，PBS漂洗；③滴加内源性过氧化物酶阻断剂(3%H2O2)，室温孵育10min，PBS冲洗；④滴加一抗(E7/P16/Ki-67)，37℃孵育60min，PBS冲洗；⑤滴加二抗，室温孵育20min，PBS冲洗；⑥滴加新鲜配制的DAB显色液，室温下孵育3～5min，光镜观察染色结果，蒸馏水冲洗终止染色；⑦苏木精复染，返蓝，脱水，透明，封片。

5.结果判定：以细胞中出现棕黄或棕褐色着色为阳性，P16以细胞核或胞质着色为阳性，Ki-67以细胞核着色为阳性，E7以细胞质或少数胞核着色为阳性；在宫颈细胞蜡块中，根据免疫组化检测阳性上皮细胞的百分比评分,分为0分(-,阳性肿瘤细胞<5%)、1分(+,阳性肿瘤细胞为≥5%且<25%)、2分(++,阳性肿瘤细胞为≥25%且<50%)、3分(+++,阳性肿瘤细胞为≥50%)；在宫颈组织蜡块中，分为0分(-，全层细胞无阳性表达或局限于上皮的基底及副基底层)、1分(+,阳性细胞小灶区分布或位于上皮下1/3)、2分(++,阳性细胞弥漫分布或位于上皮下2/3)、3分(+++,阳性细胞弥漫分布或位于上皮下2/3以上乃至全层)；≥2分为阳性。

6. 统计学方法：采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行统计分析。计数资料用率(%)表示，组间比较采用χ2检验、Fisher确切概率，两两比较时经过Bonferroni法校正P值。有序分类变量的相关性用Kendall′sTb系数表示，二分类变量的相关性用Kappa系数表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.E7、P16和Ki-67在宫颈细胞蜡块中的检测结果：ASC-US组和LSIL组E7、P16和Ki-67的表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)，ASC-H组仅2例且组织学诊断均为HSIL，故共分为3组进行统计学分析，即NILM组、LSIL组(包括ASC-US、LSIL)及HSIL+组(包括ASC-H、HSIL、SCC)。HSIL+组E7、P16和Ki-67的阳性率均明显高于LSIL组及NILM组，差异有统计学意义(P<0.05)；LSIL组与NILM组E7、P16和Ki-67的阳性率比较差异均无统计学意义(P>0.05，图1，表2)。

表2 宫颈细胞蜡块中E7、P16和Ki-67的检测结果[n(%)]

2.E7、P16和Ki-67在宫颈组织蜡块中的检测结果：HSIL+组E7、P16和Ki-67的阳性率均明显高于LSIL组及NILM组，差异有统计学意义(P<0.05)；LSIL组与NILM组P16和Ki-67的阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；LSIL组E7的阳性率明显高于NILM组，差异有统计学意义(P<0.05，图2，表3)。

表3 宫颈组织蜡块中E7、P16和Ki-67的检测结果[n(%)]

3.E7与P16、P16/Ki-67表达的一致性：在宫颈细胞蜡块及组织蜡块中，E7与P16的表达均有良好的一致性(Kendall′sTb系数分别为0.741和0.719，P=0.000)；E7与P16/Ki-67的表达均有良好的一致性(Kappa值分别为0.773和0.591，P=0.000)，详见表4、表5。

表4 E7与P16表达的一致性

表5 E7与P16/Ki-67表达的一致性

4.E7、P16/Ki-67及E7与P16/Ki-67联合检测的诊断效能：在宫颈胞蜡块中E7检测的敏感度均较P16/Ki-67检测高，两者联合检测的敏感度和阴性预测值均高于P16/Ki-67单独检测(表6)。

讨 论

宫颈脱落细胞学检查是宫颈癌筛查中应用最为广泛的筛查方法。近年来，薄层液基细胞学技术的应用，能够更好地指导临床，但细胞学筛查易受标本质量及主观因素例如操作和读取结果的影响，具有一定的局限性。宫颈脱落细胞学标本只能保存20余天，将剩余标本制备成细胞蜡块，可长期保存，并且能够进行多项免疫组化辅助诊断，并且免疫组化技术成熟，操作简便易行，检测成本较低，有助于临床广泛应用。有研究表明，在标准化细胞蜡块中进行免疫组化标记比常规细胞学具有更好的诊断准确性，并可用于初步筛选[5]。本研究是应用免疫组化染色检测E7、P16/Ki-67在宫颈细胞学蜡块及对应组织学蜡块中的表达。

P16是一种肿瘤抑制基因，是一种细胞周期依赖激酶抑制因子，负向调节细胞的增殖与分裂，其过表达与HR-HPV感染密切相关；Ki-67是一种与细胞增殖周期相关的细胞核抗原，表达于除G0期外的增殖期细胞的细胞核内，常用于反映细胞的增殖活性[11]。研究显示，P16/Ki-67的表达在宫颈上皮内病变中随着病变程度的增强而增强，可以有效鉴别HSIL与LSIL[12]。本研究结果显示，P16/Ki-67的表达在NILM组、LSIL组及HSIL+组中的表达依次增高，且HSIL+组的表达显著高于NILM组及LSIL组，差异有统计学意义(P<0.05)，本研究结果与Calil等[7,12]的研究结果相符。但是仍有部分病例P16/Ki-67的检测难以诊断，有无标志物能够辅助P16/Ki-67对HSIL与LSIL的鉴别，本研究对此进行了探讨。

HR-HPV能够引起宫颈高度上皮内病变或宫颈癌。E6和E7是HPV中最重要的致癌基因，E6/E7mRNA是癌基因的转录产物，E6/E7蛋白反应基因表达活性与宫颈病变的严重程度[1]。有研究表明，HPV E6/E7mRNA检测在诊断HSIL+方面具有重要价值[13～16]。但mRNA的检测不仅技术要求及成本高，而且mRNA易降解，检测稳定性差，不适用于临床筛查及广泛应用。E7蛋白是关键的致癌蛋白之一，因此本研究探讨E7蛋白能否作为辅助诊断HSIL+的有效指标。

本研究结果表明,宫颈细胞蜡块及相对应组织蜡块中E7的阳性率随病变级别增高而升高，且在HSIL+组明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；E7与P16/Ki-67的表达具有较好的一致性。Shi等[15]开展的研究中E6/E7检测对HSIL+的敏感度和特异性分别为71.3%和67.6%，而E6的敏感度仅为42.4%，低于E6/E7的检测，但E6的检测具有99.1%的特异性。本研究中细胞蜡块中E7对HSIL+检测的敏感度、特异性分别为55.17%和100.00%，敏感度较低但特异性高，与Shi等[15]的研究结果一致。在细胞蜡块及相对应组织蜡块中E7的敏感度均较P16/Ki-67提高，而且E7联合P16/Ki-67检测比P16/Ki-67单独检测有较高的敏感度和特异性。

综上所述，宫颈E7蛋白检测在辅助诊断宫颈高度鳞状上皮内病变中具有潜在的临床诊断价值，有望成为P16/Ki-67辅助诊断宫颈病变的重要补充标志物，为临床病理医师的诊断提供又一客观指标，在一定程度上降低诊断难度、提高诊断效率具有重要意义。