基于网络药理学的吴茱萸抗肿瘤作用机制研究

曾以旺

[摘要] 目的 基于网络药理学研究吴茱萸抗肿瘤的作用机制。 方法 采用活性成分筛选、靶点预测技术，结合生物信息学手段，预测吴茱萸抗肿瘤的潜在作用靶点，并进行信号通路分析，从而探讨其治疗肿瘤的分子机制。 结果 吴茱萸在TCMSP数据中搜索得到30个相应成分，同时利用靶点预测技术共筛选出相关靶点123个。同时在疾病基因数据库检索得到21 365个与肿瘤发生、发展有关的已知靶点基因，利用String数据库和Cytoscape软件中的网络拓扑分析共筛选得出关键靶点5个。 结论 吴茱萸作为中药对肿瘤的作用具有多成分、多靶点、协同作用的特点。

[关键词] 吴茱萸;抗肿瘤;网络药理学;作用靶点;作用机制

[中图分类号] R285          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2020）15-0131-05

Study of anti-tumor mechanism of action of Evodia rutaecarpa based on network pharmacology

ZENG Yiwang

Department of Pharmacy， Ganzhou People's Hospital， Ganzhou   341000， China

[Abstract] Objective To study anti-tumor mechanism of action of Evodia rutaecarpa based on network pharmacology. Methods The potential anti-tumor targets of Evodia rutaecarpa were predicted by active ingredient screening and target prediction technology combined with bioinformatics methods， and the signal pathway analysis was carried out to explore the molecular mechanism of tumor treatment. Results When Evodia rutaecarpa was searched in TCMSP database， 30 corresponding components were found， and 123 related targets were screened by target prediction technology. Meanwhile， 21，365 known target genes related to tumorigenesis and tumor development were retrieved from the disease gene database， and 5 key targets were selected through String database and network topology analysis in the software of Cytoscape. Conclusion As a traditional Chinese medicine， Evodia rutaecarpa has an effect on tumors which is featured multi-component， multi-target and synergistic.

[Key words] Evodia rutaecarpa; Anti-tumor; Network pharmacology; Target of action; Mechanism of action

肿瘤是指机体在各种致瘤因子的作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物。近年来， 肿瘤发病率呈高发趋势，病死率逐年上升，已经严重威胁了人类的生命安全。中医对肿瘤早有记载， 宋代之前将生于体内的肿瘤称为癥瘕、积聚等。《诸病源候论》记载：“积聚者，由阴阳不和，脏腑虚弱，受于风邪，搏于脏腑之气所为也”。《景岳全书》提及“脾肾不足及虚弱失调之人，多有积聚之病”。中医认为肿瘤是正气不足、脏腑失调而导致气滞血瘀、痰凝毒聚、毒热蕴结形成肿块，名曰“瘤”、“岩”[1]。目前对于肿瘤的治疗手段主要有手术、化疗、放疗等，化疗药物种类繁多，具有良好的治疗效果，但毒副作用较大，长期应用后肿瘤细胞易产生耐药性。中药是中国传统医学的重要组成部分，许多中药通过多靶点、多途径、多效应治疗肿瘤，同时具有不良反应少、机体耐受性好等优势，在治疗恶性肿瘤方面发挥了重要作用[2]。

吴茱萸是芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.） Benth. var. officinalis（Dode） Huang或疏毛吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.） Benth. var. bodinieri（Dode） Huang的干燥近成熟果实，性味辛、苦、热;有小毒;归肝、脾、胃、肾经;有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效[3]。现代研究表明，吴茱萸能够抑制肿瘤细胞活性与增殖、阻滞肿瘤细胞的细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞自噬、抑制肿瘤微血管形成与肿瘤迁移[4]，因此吴茱萸常以单方或复方的形式被广泛用于肿瘤相关疾病，但其具体作用机制尚未阐明。

网络药理学是基于系统生物学的原理阐释疾病发展的过程，进一步利用网络平衡的整体观来认识药物与机体相互作用的一种新兴技术，具有“多基因、多靶点”的特点，开创了一种多靶点与多种疾病间复杂网状关系的新型模式，在复杂疾病发病机制及治疗靶标的研究方面具有重要的应用价值[5]。网络药理学研究策略具有整体性、系统性的特点，这与中医药整体观与辨证论治的原则相契合[6-7]。因此，构建中药网络药理学动态的药动学模型，可以从机制方面表征药物对疾病进展的影响，对分析药物间相互作用和稳态反馈机制具有重要意义[8]。因此，本文运用网络药理学方法，研究吴茱萸抗肿瘤的多成分、多靶点和多通路作用机制，以期为吴茱萸的临床使用提供依据，现报道如下。

1 相关数据库与软件

活性成分及靶点的获取：TCMSP数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）;靶点对应基因的查找：Uniprot数据库（http：//www.uniprot.org/）;疾病靶点的获取：Genecards数据库（http：//www.genecards.org/）;关系图的绘制：Draw Venn网站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）;交互网络构建：Cytoscape3.7.1软件;通路分析：Metascape数据库（http：//metascape.org/gp/）及DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）。

2 實验方法

2.1 吴茱萸活性成分的获取与筛选

采用TCMSP数据库（http：//lsp. nwu. edu. cn/tcmsp.php），获取吴茱萸的化学成分;通过口服利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18）对吴茱萸相关活性成分进行筛选，得出吴茱萸目标活性成分。

2.2 活性成分作用靶点的获取

采用TCMSP数据库获得目标成分所对应的作用靶点，并在UniProt数据库（http：//www.uniprot.org/）中查找作用靶点的相关标准基因，删掉重复项后得到目标成分对应的基因靶点。

2.3 “目标成分―对应靶点”网络构建

将上述获得的成分及靶点导入Cytoscape 3.7.1软件，建立吴茱萸“成分-靶点”知识网络，以直观地研究各成分与靶点之间的关系网络。

2.4 疾病靶点的获取

基于Genecards、TTD、Drugbank数据库和相关文献获取与肿瘤相关的靶点。

2.5 吴茱萸抗肿瘤作用靶点的预测

将上述两步得到的吴茱萸目标活性成分靶点与抗肿瘤相关靶点导入Venn数据库（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）进行交互分析，获得交集靶点，建立吴茱萸目标成分-疾病-靶点的信息网络。

2.6 蛋白相互作用网络构建与分析

将交互靶点导入String数据库（https：//string-db.org/cgi/），只计算物种为Homo sapiens的蛋白相互网络关系，以节点（node）和边（edge）表示靶点关联程度。同时采用Cytoscape 3.7.1软件对所得结果进行拓扑分析，并运用中位数卡方原则，经“Dgreement”和“Clossment”参数比对确定关键靶点[9]。

2.7 富集分析

将关键靶点导入FUNRich 6.0软件，物种限定为Homo sapiens，对关键靶点所涉及的细胞功能（CC）、分子功能（MF）、生物功能（BP）和信号通路（PW），以P值<0.05为阈值，完成关键靶点的富集分析。

3 结果

3.1 吴茱萸活性成分的获取

从TCMSP数据库中获取吴茱萸的化学成分，通过筛选符合口服利用度（OB）≥30%以及类药性（DL）≥0.18的化学成分，并结合ADME分析[10]，筛选得到符合条件的活性成分共计30个，化合物具体信息见表1。

3.2 吴茱萸抗肿瘤的相关靶点信息

将从 TCMSP数据库并结合文献挖掘方法收集到的基因进行整理，删除重复项后共123个相关靶点;采用GeneCards数据库获取与肿瘤相关的靶点共21 365个，建立肿瘤疾病靶点库;将收集到的吴茱萸成分靶点与肿瘤疾病靶点进行交互分析，结果显示吴茱萸目标成分所对应的123个靶点中有113个与肿瘤有关。见封三图9、表2。

3.3 PPI分析结果

将交互基因信息导入String数据库，设置每个靶点要显示的最大交互程序数不超过50条，获得蛋白质相互作用网络构图（封三图10），其中节点有113个，边有1066条，实验结果解释吴茱萸抗肿瘤的各个靶点之间联系紧密。同时采用中位数原则，经“Dgree ment”和“Clossment”参数进行筛选，共得到5个主要的靶点：MAPK14、PDE10A、ACACA、EGFR、IL1B。

3.4 GO分析和KEGG富集分析

采用FUNRich和KORAS数据对交互靶点进行GO分析结果，见图1。细胞组分（CC）分析数据表明吴茱萸可调节细胞内外空间环境，改变细胞膜表面受体表达能力以及细胞器活动等。分子功能（MF）分析得出吴茱萸可直接影响G蛋白偶联受体相关活性、配体依赖性核受体相关蛋白、谷胱甘肽转移酶活性、肽酶活性、细胞外配体门控离子通道活性、细胞因子活性、跨膜受体蛋白活性、催化活性、辅因子结合、电压门控离子通道活性等多途径发挥抗肿瘤活性。同时生物途径（BP）分析得出吴茱萸可影响肿瘤细胞的能量代谢、细胞通讯和信号传导、核心蛋白代谢等途径来干预肿瘤细胞增殖。

信号通路分析结果得出（图2），吴茱萸可直接干预IL-3、IL-5等相关炎症家族、雷帕霉素（mTOR）、γ-IFN等30条信号通路发挥抗肿瘤活性。这一结果解释吴茱萸可抑制肿瘤细胞能量代谢通路和炎症通路，从而阻断炎症浸润的出现;并激活细胞自噬通路，加快肿瘤细胞的凋亡。

4 结论

肿瘤根据其临床特点，在中医范畴内被称为癥瘕、积聚等。肿瘤细胞归属于“邪气”，常见肿瘤患者临床症见肿块、出血、脏器梗阻等。由吴茱萸组成的方剂中最常用的为“左金丸”，出自《丹溪心法》，历史悠久，临床应用广泛，其主要成分小檗碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱等均有良好的抗肿瘤活性，且左金丸在治疗胃癌的实验研究方面取得了一定的研究进展[11]。

本实验采用网络药理学对吴茱萸抗肿瘤成分和作用机制进行系统研究，结合口服利用度（OB）和类药性（DL）筛选出吴茱萸与抗肿瘤相关的活性成分共30种。利用Cytoscape软件构建吴茱萸“成分-靶点”网络，揭示吴茱萸具有多成分、多靶点的作用特点。分子对接结果显示，涉及123个靶点，其中113个与肿瘤有关，这一结果说明吴茱萸目前具有确切的抗肿瘤作用。结合相关数据库对吴茱萸抗肿瘤靶点进行分析得出吴茱萸可抑制肿瘤细胞能量代谢过程、DNA转录过程和信号传导过程，激活或抑制与肿瘤细胞有关的30条信号通路来干预肿瘤细胞的扩散和炎症因子浸润现象的发生。

将交互基因进行PPI映射并构建网络，对网络分析后发现多个与抗肿瘤紧密相关的靶点，其中主要作用靶点为MAPK14、PDE10A、ACACA、EGFR、IL1B。MAPK激酶作为多种生化信号的整合点，可参与细胞增殖、分化、转录调控和发育等多种过程[12-14]。其可被各种环境压力和促炎细胞因子激活。包括转录调节因子ATF2、MEF2C和MAX细胞周期调节因子CDC25B和肿瘤抑制因子p53[15]，在轉录水平调控凋亡相关蛋白，进而诱导凋亡发生，完成抑制肿瘤细胞分裂增殖进而杀死肿瘤细胞的目的。PDE10A是一个已知的用于治疗精神类疾病的药物靶点，其可通过调节脑垂体海马区活动来调节精神性疾病，也可干预激素的分泌或激活MAPK相关通路以致肿瘤细胞快速增殖[16]。EGFR是表皮生长因子受体（HER）家族成员之一，对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用，可激活MAPK加快肿瘤细胞分化。因此MAPK、EGFR和PDE10A是相互干预、协作的靶点[17]。ACACA是催化长链脂肪酸生物合成中的限速反应的一种酶，脂肪酸的合成和代谢对于细胞能量的产生，特别是在糖酵解活性低的肿瘤细胞中具有至关重要的作用。IL1B是一种在生理和病理状态下均具有多重作用的多效性因子，并且通过生长因子的表达，可推断为肿瘤发生进展的一个重要靶点。肿瘤微环境中高浓度的IL1B可刺激肿瘤的生长，且产生IL1B的肿瘤患者预后通常较差。

基于以上结果，本研究应用网络药理学方法，对吴茱萸抗肿瘤机制进行了初步探讨，吴茱萸中每个化合物可调控多个靶点，同一靶点可参与多个信号通路和生物学过程，体现了吴茱萸多成分、多靶点、多途径的抗肿瘤活性。化合物-靶点-相关疾病网络中度值较高的靶点，参与多个重要的信号通路和生物学过程，为吴茱萸抗肿瘤的研究与临床应用提供了科学依据，也为进一步阐明中药吴茱萸的潜在作用机制奠定了基础和提供了新思路，但其具体作用机制并不可知，因此后期将对吴茱萸抗肿瘤作用机制进行详细研究。

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（收稿日期：2020-03-06）