超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法测定乳清蛋白粉中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

2020-08-03郑云鹏董洪涛张凤霞

分析测试学报 2020年7期

杜娟，郑云鹏，董洪涛，张凤霞*

(1.黑龙江飞鹤乳业有限公司集团实验室，北京 100015；2.飞鹤(龙江)乳品有限公司，黑龙江齐齐哈尔 161100)

α-乳白蛋白(α-La)是乳清蛋白中主要的优质蛋白，主要存在于哺乳动物的乳汁中，能作为载物与钙、镁、锰、钠、钾以及锌结合[1-2]，约占乳清蛋白的10%～20%[3-5]，在牛乳中占总蛋白质的2%～3%，在母乳中占总蛋白质的20%～25%[2]。α-La能提供最接近母乳的氨基酸组合，促进婴儿的大脑发育，同时还提高蛋白质的生物利用率，降低蛋白质总量，从而有效减轻肾脏负担。β-乳球蛋白(β-Lg)是牛乳中的主要乳清蛋白，约占牛乳总蛋白的10%，占乳清蛋白的40%～50%[6-9]。据报道，近两年全国婴幼儿配方乳粉产量约90万吨，其原料绝大多数为牛乳，并且添加了脱盐乳清粉、乳清蛋白粉、浓缩乳清蛋白粉等蛋白类原料来调整蛋白质比例，使其接近母乳水平[10]。据估算乳清粉类原料用量约为婴幼儿配方乳粉产量的8%～25%，因此乳清蛋白粉的品质优良至关重要。而乳清蛋白粉中α-La和β-Lg的含量是衡量其品质的关键指标。

目前，α-La和β-Lg含量检测的报道较少，已有方法有凝胶色谱法[11]、高效液相色谱法[12-13]、毛细管电泳法[14]、液相色谱-质谱联用法[15-17]、酶联免疫法(ELISA)[18]等。然而，目前的检测方法主要是针对婴幼儿配方奶粉、牛乳等样品基质。而针对乳清蛋白类原料等的分析研究主要停留在总蛋白含量测定水平上，尚无相应的标准方法检测α-La和β-Lg含量，已有的反相高效液相色谱法特异性较差[10]，不可避免地产生了乳清蛋白粉的监管盲区。针对上述情况，本研究基于三重四极杆质谱MRM/SRM定量思路的靶向蛋白质组学技术，利用蛋白专属的肽段序列完成定量分析。方法通过采用碱性胰蛋白酶为酶切工具，烷基化与酶解乳清蛋白类原料，特异肽段内标法超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪(UPLC-MS/MS)分析，降低了复杂样品中共流出的背景干扰，从而实现了UPLC-MS/MS对乳清蛋白粉类样品中α-La和β-Lg含量的准确测定。本方法前处理简单快速，试剂用量少，定量准确，对实际乳清蛋白粉类样品的检测结果令人满意。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱(Xevo-TQD，沃特世科技(上海)有限公司)；电子分析天平(ME204，梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司)；涡旋混合器(VORTEX-2，美国Scientific Industries公司)；超声波水浴(KQ-700DE，昆山超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水器(Milli-Q Advantage A10，默克化工技术有限公司)。

牛α-La特异肽段(序列 VGINYWLAHK，分子量 1 199.7 Da，纯度≥99%)；牛β-Lg特异肽段(序列：IDALNENK，分子量 915.5 Da，纯度≥99%)；牛α-La同位素特异肽段(序列：VGI*NYWL*AHK，分子量1 214.4 Da，纯度≥95%)；牛β-Lg同位素特异肽段(序列：I*DAL*NENK，分子量 929.5 Da，纯度≥95%)；碳酸氢铵(生化试剂级)、二硫苏糖醇(DTT,生化试剂级)、碘代乙酰胺(IAA，生化试剂级)、碱性胰蛋白酶(生化试剂级)。以上特异肽段、同位素特异肽段及试剂均由杭州璞湃科技有限公司提供。

乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯,美国默克公司)。共计5个国外品牌的脱盐乳清粉D70、7个国外品牌的脱盐乳清粉D90、3个国外品牌浓缩乳清蛋白粉和1个国外品牌α-乳白蛋白粉，共计16个。样品均由黑龙江飞鹤乳品有限公司提供。实验用水均为二级水。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制α-La和β-Lg混合标准溶液(2 μmol/L)：标准品20 nmol，准确加入10 mL水定容，即得α-La和β-Lg(2 μmol/L)混合标准溶液，并于-20 ℃冰箱中保存。

α-La-IS和β-Lg-IS的混合同位素内标使用液(2 μmol/L)：标准品20 nmol，准确加入10 mL水定容，即得α-La-IS和β-Lg-IS(2 μmol/L)混合内标标准溶液，并于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 样品前处理烷基化与酶解：称取适量试样1.0 g，置于25 mL具塞玻璃比色管中，先用5 mL水溶解，再定容至刻度。移取25 μL至2 mL离心管中，加入200 μL内标混合溶液和10 μL的二硫苏糖醇(DTT)还原，50 ℃反应30 min。冷却至室温后加入30 μL的碘代乙酰胺(IAA)烷基化后，静置30 min，加入200 μL缓冲溶液(500 mmol/L碳酸氢铵)、10 μL增活剂CaCl2和50 μL碱性胰蛋白酶溶液，37 ℃恒温酶解过夜，10 μL甲酸终止酶解。采用水定容至1 mL，过0.22 μm滤膜后供超高效液相色谱-串联质谱仪进行分析。

1.2.3 测定条件色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC-BEH C18，300Å(100 mm×2.1 mm i.d.,1.7 μm)；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.3 mL/min。梯度洗脱程序：0～1 min，5%B;1～4.5 min，5%～40%B；4.5～4.6 min，40%～100%B；4.6～6.0 min，100%B；6.0～6.1 min，100%～5%B；6.1～8 min，5%B。质谱条件：电喷雾模式：ESI+；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；离子喷雾电压：3.0 kV；脱溶剂温度：500 ℃，脱溶剂气流量：800 L/h；干燥气：氮气；碰撞气：氩气；MRM参数见表1。

表1 α-La和β-Lg及其内标在MRM模式下的主要质谱参数Table 1 MS parameters of α-La，β-Lg and their internal standards(IS) under multiple reaction monitoring(MRM) mode

2 结果与讨论

2.1 特异性多肽的选择

本文选择碱性胰蛋白酶作为酶切工具，将蛋白粉中的α-La和β-Lg酶切形成肽段。利用其高度专一性，水解精氨酸与赖氨酸羧基端的肽键。通过Uniprots数据库的PeptideMass工具分析，α-La和β-Lg理论上可以通过酶解获得9条和13条长短不一的多肽产物，从MS系统的检测性和稳定性上考虑，应选择特定氨基酸上修饰少，长度6～12个氨基酸的多肽作为目标肽段[19]。其中氨基酸数量少于6个的肽段不具有足够的特异性，氨基酸数量大于12个的肽段色谱分辨率低，故不进行进一步分析。经筛选其中α-La有2条肽段VGINYWLAHK和LDQWLCEK，β-Lg有6条肽段TPEVDDEALEK、VLVLDTDYK、WENGECAQK、LIVTQTMK、IDALNENK和ALPMHIR符合要求。本文通过单离子扫描模式(SIM)与MRM方式对各个多肽的响应值进行评估，最终选择色谱分离过程中无干扰、响应值高的VGINYWLAHK和IDALNENK分别作为α-La和β-Lg的特异性多肽。通过Uniprots数据库的BLAST分析工具对牛乳中的其他已知蛋白进行比对分析，未在其他蛋白质中发现本肽段的存在。表明本文选择的多肽具有高度的特异性。

在应用UPLC-MS/MS法检测多肽时，多肽的响应值受到基质以及参与反应的化学试剂的影响，导致响应信号增益或抑制。基于上述问题，本文选择同位素特异肽VGI*NYWL*AHK和I*DAL*NENK作为内标，在预处理之前加至被测样品中。同位素特异肽的理化性质与目标多肽完全一致，色谱-质谱行为也一致(见图1)，能校正由基质效应所带来的检测响应值波动。实验结果表明，选用同位素标记内标肽段不但能降低基质效应还能校正样品前处理过程的误差。

图1 乳清蛋白粉样品中α-La和β-Lg特异肽及其同位素特异肽的色谱图Fig.1 Chromatograms of α-La and β-Lg signature peptides and their isotope-labeled analogs in the whey powder samples

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱的选择C4和C18的固定相均由疏水烷基链构成，蛋白质组分与反向固定相的疏水作用大小除与反相固定相的烷基链长有关外，还与蛋白质的疏水性相关。C4的烷基链较短，更适合分离质量大的蛋白，而小分子的多肽需用烷基链更长、疏水性较强的C18分离。本实验选用C18色谱柱，分别考察了Waters ACQUITY UPLC-BEH C18，300 Å(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和Waters ACQUITY UPLC-BEH HILIC(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)2款色谱柱对分离效果的影响。结果显示，前者能将标准特异肽段、同位素特异肽段分离，且目标物的出峰时间短，峰形好，可以满足质谱定量的峰形要求；而后者得到的峰形较宽，峰形拖尾不对称(图2)。因此，本实验选择Waters ACQUITY UPLC-BEH C18，300 Å色谱柱进行实验。

图2 采用BEH HILIC色谱柱分离的标准特征肽段的MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms of α-La and β-Lg separated with a BEH HILIC column

2.2.2 流动相的优化乳清粉中蛋白的极性较大，常用乙腈和水作为流动相[20]。本实验考察了乙腈和水的流动相体系，发现色谱峰毛刺较多且拖尾。考虑到待测物的化学性质，分别尝试乙腈-0.1%甲酸水溶液的流动相体系和0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液的流动相体系。对比后发现在乙腈和水中均加入甲酸可改善目标化合物的峰形。推测一方面是由于待测化合物的化学结构含有酸性或碱性基团，另一方面是甲酸可通过调节流动相pH，与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用来改善峰形，克服毛刺和拖尾问题。在综合峰形和分离度前提下，最终选择的流动相及梯度洗脱条件如“1.2.3”所述。

2.3 标准曲线与检出限

用0.1%甲酸水溶液分别配制系列浓度为40、100、200、500、1 000 nmol/L的α-La标准溶液，内标浓度为400 nmol/L；浓度为80、200、400、1 000、2 000 nmol/L的β-Lg标准溶液，内标浓度为400 nmol/L。以α-La和β-Lg的特异肽段定量离子浓度(X)为横坐标，对应的目标分析物与同位素内标峰面积的比值(Y)为纵坐标绘制标准曲线。结果显示，α-La和β-Lg分别在40～1 000 nmol/L和80～2 000 nmol/L范围内线性关系良好，相关系数(r)分别为0.998 7和0.998 9。以信噪比S/N≥10计算方法的定量下限(LOQ)，得到α-La和β-Lg的定量下限均为0.020 g/100 g。方法的灵敏度可满足乳清蛋白粉中目标物的检测要求。

2.4 加标回收率与相对标准偏差

称取1 g脱盐乳清粉D70作为本底，α-La和β-Lg加标量分别为本底含量的0.5、1.0、1.5倍，即α-La的3个加标水平分别为0.75、1.50、2.25 g/100 g，β-Lg的3个加标水平分别为2.50、5.00、7.50 g/100 g。在优化实验条件下，将每个加标水平平行测定6次，其平均回收率为84.7%～95.6%，相对标准偏差(RSD)为1.6%～5.8%(见表2)。方法的准确度及精密度能够满足定量分析的基本要求。

表2 脱盐乳清粉D70中α-La和β-Lg的3水平加标回收率与相对标准偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of α-La and β-Lg in demineralised whey powder 70% at three spiked levels(n=6)

2.5 乳清蛋白粉中α-La和β-Lg的含量分析

脱盐乳清粉是将原料乳清中的矿物盐脱去，改变乳清中的离子平衡后即可得到。若将乳清直接烘干得到乳清粉末，再经过澄清、超滤、干燥等过程即可得到浓缩乳清蛋白。浓缩乳清蛋白根据过滤程度不同，可以得到蛋白浓度从34%～80%不等的产品[12,21]。而脱盐乳清粉、浓缩乳清蛋白粉和α-乳白蛋白粉常作为蛋白类原料应用于婴幼儿配方食品中，用于调整牛奶中α-La的比例。本实验选取了5个国家的4类乳清蛋白粉共计16个样品为代表性基质，其中脱盐乳清粉D70 样品5个，脱盐乳清粉D90样品7个，浓缩乳清蛋白粉样品3个，α-乳白蛋白粉样品1个。对其中α-La和β-Lg含量按“1.2”方法进行前处理及测定，检测值均以10 d连续双平行测量的平均值进行统计，结果见表3～4。

表3 脱盐乳清粉D70、D90中α-La和β-Lg的含量Table 3 Content of α-La and β-Lg in demineralised whey powder 70% and 90%

表4 浓缩乳清蛋白粉和α-乳白蛋白粉中α-La和β-Lg含量Table 4 Content of α-La and β-Lg in whey protein concentrate and α-lactalbumin powder

由表3～4可知，脱盐乳清粉D70中,α-La和β-Lg的含量分别为 1.38～1.95 g/100 g和4.20～4.81 g/100 g；脱盐乳清粉D90中，α-La和β-Lg的含量分别为 1.24～2.03 g/100 g和3.65～6.21 g/100 g；浓缩乳清蛋白粉中,α-La和β-Lg的含量分别为 8.98～11.36 g/100 g和37.12～42.03 g/100 g；α-乳白蛋白粉中,α-La和β-Lg的含量分别为31.35 g/100 g和15.32 g/100 g。通过对这3类蛋白粉中α-La和β-Lg含量进行对比分析，可以看出全部样品均检出α-La和β-Lg。其中，脱盐乳清粉D70和D90由于制作工艺相近，只是脱去矿物质程度不同，因此其测得α-La和β-Lg的含量基本一致。浓缩乳清蛋白粉中α-La和β-Lg含量约为脱盐乳清粉的6～10倍，而且3种乳清蛋白粉中β-Lg的含量约为α-La的2.15～4.67倍，与文献一致[22]。本实验在α-乳白蛋白粉中检出β-Lg，可能是由于α-乳白蛋白粉的生产工艺所决定。α-乳白蛋白粉由乳清粉进行超滤、浓缩、喷雾干燥得到，其中的α-La含量较其他种类乳清粉高，但是β-Lg并未完全去除。所以α-乳白蛋白粉中还会残留少量的β-Lg，但经过浓缩后其α-La和β-Lg的含量较脱盐乳清粉D70和D90中的高。

同一样品检测数据的日间平行性很好(RSD≤9.1%)，表明同类样品不同品牌间波动性不大，所以做整体平均数时，采取平均值计算，可保障样品中含量的普遍性。检测结果还显示，不同类产品中α-La含量最高为α-乳白蛋白粉，β-Lg含量最高为浓缩乳清蛋白粉，脱盐乳清粉D70和D90中的α-La和β-Lg含量均低于另外两种蛋白类产品。生产中可以根据实际需要，选择添加不同种类的乳清蛋白粉。