四磨汤治疗功能性胃肠病机制的网络药理学分析

李跃文，刘志强，朱晓芹，郑 雅，王博龙

（1.宜春学院化学与生物工程学院，江西，宜春 336000； 2. 鹤壁市天然药物研究与开发重点实验室，河南，鹤壁 458030）

功能性胃肠病（functional gastrointestinal disorder，FGIDs）是指具有慢性和复发性消化道症状，但缺乏解剖、生化和病理学依据的一组消化道功能紊乱性疾病，主要表现为腹胀、腹痛、腹泻及便秘等症状，功能性消化不良和肠易激综合征被认为是最常见的病种[1]。本病发病机制复杂，涉及胃酸、胃肠运动功能障碍、内脏感觉异常、幽门螺旋杆菌感染、精神心理等多种因素的共同作用。西医常使用强效单靶点的抑酸药奥美拉唑，胃肠动力调节药多潘立酮等来治疗，虽能缓解患者症状，但难以根治，且存在不同程度的毒副作用[2-3]。因此，寻找高效低毒的治疗药物是FGIDs研究的重要方向。

四磨汤源于宋代名医严用的《严氏济生方》，由槟榔、乌药、枳壳、木香四味中药组成，具有消积止痛、顺气降逆之功效。它是治疗FGIDs的经典名方，由其精制而成的四磨汤口服液获批为肠胃用药中药保护品种。现代药理学研究[4-5]表明，四磨汤可促进慢性应激小鼠胃排空和肠推进，调节不同机能状态小鼠胃肠运动功能，组方中药槟榔及枳壳的有效活性成分槟榔碱及橙皮苷均可促进患者胃肠平滑肌收缩[6-7]。上述研究部分揭示了四磨汤作用的点状或线性机制，但难以概全。本研究应用网络药理学的方法，分析四磨汤主要药效成分、潜在靶点和信号通路之间的关系，为四磨汤治疗FGIDs的开发利用提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 活性成分选取

根据文献[8-13]报道将四磨汤中槟榔次碱、槟榔碱、去甲槟榔次碱、去甲槟榔碱、木香烃内酯、去氢木香内酯、儿茶素、乌药醇、乌药碱、乌药醚内酯、橙皮苷、川陈皮素、辛弗林、新橙皮苷、柚皮苷、柚皮素等22 个化学成分作为其活性成分纳入研究。通过美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库的PubChem Compound栏目搜索上述22种活性成分信息，在线下载药效成分的化学结构，保存为sdf格式文件。

1.2 分子对接与药物靶点筛选

运用TCMSP及BATMAN-TCM数据库检索活性成分已知靶点；登陆Pharm Mapper 反向分子对接服务器，上传四磨汤主要活性成分的sdf格式文件，采用反向药效团匹配方法补充潜在靶点。利用UniProt数据库将得到的药物靶点PDB ID转换成GeneCards数据库的基因名称，利用GeneCards、DisGeNET、OpenTargets、CTD数据库以“functional gastrointestinal disorder”“functional dyspepsia” “irritable bowel syndrom”为关键词，收集与FGIDs相关的共同靶点，并与四磨汤中活性成分靶点映射找重，得到四磨汤中活性成分治疗FGIDs靶点，采用Cytoscape 3.5.1 软件建立四磨汤活性成分-靶点网络图。

1.3 靶蛋白相互作用网络构建

为明确四磨汤治疗FGIDs主要靶蛋白，将筛选得到的靶蛋白在STRING平台（https：//string -db. org/）构建靶蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络模型，将蛋白种类设置为“Homo sapiens”（人类）进行操作，最低相互作用阀值设为中等“medium confidence”，其它参数保持默认设置。将PPI网络模型导入Cytoscape 3.5.1软件，利用“Network Analysis”功能计算各靶蛋白的网络度值（Degree）、介数（Betweenness）拓扑参数，靶蛋白的Degree、Betweenness越大，该靶蛋白在网络中的位置就越重要。选取Degree、Betweenness同时在平均值之上的靶点作为四磨汤治疗FGIDs的主要靶点。

1.4 KEGG 富集分析

将四磨汤治疗FGIDs 的靶点在DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）平台进行KEGG通路富集，分析研究四磨汤治疗FGIDs的主要通路。

2 结果

2.1 主要活性成分信息

通过文献挖掘得到四磨汤中22 种活性成分，基本信息如表1 所示。

表1 四磨汤主要活性成分基本信息 Table 1 Main active ingredients basic information of Simo Decoction

2.2 四磨汤活性成分-靶点网络的构建

通过BATMAN-TCM、TCMSP数据库及Pharm Mapper反向分子对接服务器获取四磨汤活性成分对应的 688 个靶点，将 688 个靶点与利用GeneCards、DisGeNET、OpenTargets、CTD基因数据库中共同的979 个FGIDs相关靶点映射找重，得到四磨汤活性成分治疗FGIDs的190 个靶点。如图1所示，建立四磨汤活性成分-靶点网络图，图中212 个节点、1501 条相互作用连线，展现了四磨汤多成分、多靶点的药理作用。

图1 四磨汤活性成分-作用靶点网络 Fig. 1 Active components-targets network of Simo Decoction

2.3 PPI 网络构建

如图2 所示，每个参与互作的靶蛋白用一个节点表示，节点面积越大表示其Degree越大，节点颜色越深代表其Betweenness越大，PPI网络中包含184个节点（6 个靶蛋白未参与PPI网络构建），2131 条相互作用连线，PPI网络度值与介数中心性分布如图3 和图4 所示，平均度值为26，平均介数（betweenness）为6.87×10-3，其中31 个靶蛋白参数均在两者平均值之上（如表2），说明这31 个靶蛋白可能是四磨汤治疗FGIDs的主要靶点。

图2 靶蛋白PPI 网络 Fig.2 The PPI network of target protein

图3 度值分布 Fig.3 The Degree distribution

图4 介数中心性 Fig.4 The Betweenness Centrality

表2 关键靶点与拓扑参数 Table 2 The key targets and the topological parameters

2.4 KEGG 代谢通路分析

将四磨汤190 个治疗FGIDs 靶点进行KEGG代谢通路富集，根据P-value＜0.05 筛选得到与FGIDs 相关信号通路17 条（图5）。其中富集靶点最多的是神经活性配体受体相互作用信号通路（Neuroactive ligand-receptor interaction）；富集因子较大且与功能性胃肠疾病密切相关的是5-羟色胺能突触（Serotonergic synapse）、cAMP 信号通路（cAMP signaling pathway）、TNF 信号通路（TNF signaling pathway）、多巴胺能突触（Dopaminergic synapse）、HIF-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）、钙信号通路（Calcium signaling pathway）、VEGF 信号通路（VEGF signaling pathway）、T 细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway）、NF-κB 信号通路（NF-kappa B signaling pathway）。

图5 KEGG 信号通路富集 Fig.5 Enrichment of KEGG signaling pathways

3 讨论

中医药在慢性胃肠疾病的治疗上具有多成分、多靶点综合作用的优势，其疗效显著，根治率高，但药效成分不明、作用机理不清的现状严重制约其推广使用。为研究四磨汤的药效成分及作用机理，本研究以活性为导向，纳入的22 个四磨汤成分均具有胃肠活性，如槟榔碱、乌药醚内酯、橙皮苷、木香烃内酯通过降低胃内残留率，升高小肠推进率，有效改善慢性应激小鼠的胃肠运动功能[14]。柠檬烯具有强效的促进胃动力作用，而柚皮苷有较强的加速肠蠕动作用[15]。木香烃内酯、槟榔碱、橙皮苷、乌药醚内酯还可抑制慢性应激小鼠体内血清胆囊收缩素、结肠肌间神经丛血管活性肠肽的释放[16]。将上述22 个活性成分在药物及疾病数据库进行挖掘，发现它们能作用于190 个FGIDs 相关靶点，经PPI分析后得到主要靶点31 个。

现代医学研究表明，壁内神经系统、平滑肌细胞、间质细胞构成了胃肠运动功能的基本单元，其功能异常是造成功能性胃肠疾病的重要原因，如多种神经递质参与了致敏神经元，在肠易激综合征中起到着重要作用；而平滑肌运动障碍则与功能性消化不良密切相关[17]。其中神经体液调控紊乱在FGIDs 症状发病机制中起关键作用，目前常用的FGIDs 治疗药物正是基于此机制中的相关靶点。如多巴胺D2受体拮抗剂甲氧氯普胺、多潘立酮等，能增加胃底舒张的顺应性，同时增加胃窦平滑肌收缩，促进幽门舒张，增加胃排空效率。5-HT4受体激动剂莫沙必利、普芦卡必利、西尼必利等能增加胃肠平滑肌运动。cAMP 信号通路和钙信号通路是调控胃肠平滑肌运动的主要通路，前者能够激活蛋白激酶A，促进其磷酸化相应的功能蛋白，进而松弛平滑肌。后者则可调节细胞内的钙离子浓度，而钙离子是平滑肌兴奋-收缩偶联因子，高浓度Ca2+引起平滑肌收缩，低浓度Ca2+引起平滑肌舒张。此外，多数FGIDs 均伴随黏膜炎症，如功能性消化不良患者的胃窦和十二指肠黏膜、肠易激综合征患者结肠黏膜均有炎症，常常激发细胞免疫和体液免疫。

本研究对190 个FGIDs 相关靶点进行KEGG通路富集，发现190 个靶点富集的17 条通路大致可分为三类，即神经活性配体受体相互作用信号通路、5-羟色胺能突触、多巴胺能突触、神经营养信号通路的胃肠神经体液通路；c AMP 信号通路、钙信号通路的胃肠平滑肌运动相关通路；以及TNF信号通路、T 细胞受体信号通路、NF-κB 信号通路、花生四烯酸代谢等炎症通路。说明四磨汤治疗FGIDs 的主要机理在于调控胃肠神经传导、平滑肌运动及炎症。有实验[18-19]也证实四磨汤能够显著降低慢性应激小鼠多巴胺受体 D1，D2的表达，上调兴奋性受体 5- HT3,4的表达，改善慢传输型便秘大鼠结肠的动力。戴迟兵等[20]发现四磨汤通过介导钙通道，对大鼠胃窦平滑肌的收缩活动具有明显的兴奋作用；其中槟榔及其主要组分槟榔碱均可激活平滑肌M3受体，通过促进胞外钙内流-胞内钙释放从而促进胃肠平滑肌收缩[21]。聂子文等[22]乌药根挥发油能明显升高胃实寒大鼠血浆中的c AMP/c GMP。兰向阳等[23]发现Toll 样受体介导的NF-κB 信号通路在炎症性肠病的发生发展中起重要作用，而木香烃内酯、槟榔碱能够抑制IL-1β 基因的表达、促进NF-κB 和信号传导及转录激活因子3（STAT3）的活化，具有显著的体外抗炎活性[24-25]。

总之，本研究通过网络药理学的思路方法，充分展现了四磨汤多成分、多靶点、多通路治疗FGIDs的全貌，为深入研究四磨汤治疗FGIDs 的药理机制提供了新的思路与线索。