QuEChERS-HPLC-MS/MS法检测谷物酸奶中伏马毒素

董基

（肇庆学院食品与制药工程学院，广东肇庆，526061）

0 引 言

谷物粮食是中国传统膳食的主体，是人体理想的能量来源，还富含多种矿物质、B 族维生素和膳食纤维。以谷物和牛奶混合发酵制得的谷物酸奶，既提升了产品的口感和外观，还增加了酸奶的营养价值，使其更受消费者的欢迎。伏马毒素(fumonisin，FB)是由轮状镰刀菌、串珠镰刀菌等在合适的环境下生成的类真菌毒素，是由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物，对人体具有急性毒性及潜在的致癌性[1-3]。常见的伏马毒素有伏马毒素B1( fumonisin B1，FB1) 、伏马毒素B2( fumonisin B2，FB2) 和伏马毒素B3( fumonisin B3，FB3)，其中以FB1毒性最大[4-6]，在自然条件下，伏马毒素主要污染粮食谷物产品，若采用被伏马毒素污染的谷物生产酸奶，可能造成整个产品的污染。目前针对谷物酸奶中的真菌毒素检测，主要是黄曲霉毒素类[7-9]，关于酸奶中伏马毒素的研究报道较少，所以有必要建立一种针对谷物酸奶中伏马毒素的检测方法，对评价此类食品的安全具有重要意义。

目前伏马毒素的研究主要集中在FB1的分析检测，有高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和高效液相色谱-质谱联用法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS /MS）[10-15]。高效液相色谱法应用较为广泛，检测稳定性较好，但样品中基质易对伏马毒素产生干扰，前处理过程繁琐，且采用的免疫亲和柱成本较昂贵[16-19]。本研究运用QuEChERS 技术的净化特性，简化提取过程，尝试建立了QuECh-ERS 净化技术结合HPLC-MS /MS 法检测谷物酸奶中3 种伏马毒素( FB1、FB2和FB3) 的方法，方法灵敏度高、重现性好，降低了检测成本，可为谷物酸奶中伏马毒素的分析和监控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1260 型高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；6460型三重四级杆串联质谱仪，美国Agilent公司。

FB1溶液标准物质(100 μg/mL，lot:228012)，FB2溶液标准物质(100 μg/mL，lot:228034)，FB3溶液标准物质(100 μg/mL，lot:228038)购于中国计量科学研究院；甲醇、乙腈，均为色谱纯，德国Merck 公司产品；甲酸、乙酸，均为色谱纯，上海安谱公司产品。

1.2 样品来源

样品均为随机购买于市场上销售的谷物酸奶。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Kinetex-C18柱(2.1mm×100mm，1.7 μm)；流速：0.3 mL/min；流动相：A 为0.1%甲酸溶液，B 为甲醇，梯度洗脱程序为0～1.0 min，10%～90% B；1.0～5.0 min，90% B；5.0～6.0 min，90%～10% B；6.0～10.0 min，10% B；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。

1.3.2 质谱条件

电离模式：电喷雾正离子扫描；监测方式：MRM-IDA-EPI；IDA 参数：1000 CPS 触发启动，采用动态背景扣除模式；EPI 参数：扫描速度10 000 Da/s，扫描范围（m/z）50～900Da；EPI碰撞能量：20、35 eV。

1.3.3 样品的提取与净化

称取2.5 g（精确至0.001 g）样品置于50 mL 离心管中，加入10 mL 提取溶液，漩涡混匀30 s，振荡1.0 h，再加入盐析剂6.0 g，振荡1 min，5 000 r/min 离心5 min。取2.0 mL 上清液于离心管中，加入净化剂后涡旋10 s，离心取上清液，过膜后上机进样分析。实验分别比较不同的盐析剂、提取溶液以及净化剂组合，对3种伏马毒素检测的影响。

1.3.4 标准曲线的建立

吸取10 μL 的3 种伏马毒素的标准溶液，用甲醇定容到10.0 mL 配制成100.0 ng/mL 的中间液，再配制成1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、50.0 ng/mL 一系列标准溶液，经仪器进行分析，绘制标准曲线。

1.3.5 方法的精密度、重复性与回收率

以未检出3 种伏马毒素的谷物源性运动食品为空白基质，加入不同浓度的FB1、FB2、FB3混合标液，使用QuEChERS提取后，上机检测计算回收率。

2 结果与分析

2.1 QuEChERS前处理方法的优化

2.1.1 盐析剂的选择

QuEChERS 前处理试剂中的盐析剂多采用氯化钠、醋酸钠、无水硫酸镁、柠檬酸钠、柠檬酸钠二水合物和柠檬酸氢二钠盐倍半水合物等。对谷物中FB 检测的研究发现[7]，采用了无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠二水合物和柠檬酸氢二钠盐倍半水合物，质量比为4∶1∶1∶0.5，提取效果良好，故试验选择了该比例混合试剂作为提取剂。

2.1.2 提取溶液的选择

由于伏马菌素有较强的极性，会对提取溶液的极性表面产生较大的亲和力，因此需要高极性的溶剂作为提取溶液[20]。本实验分别配制4 种提取溶液，提取溶液Ⅰ：甲醇/水（90/10，v/v）、提取溶液Ⅱ：甲醇/水（80/20，v/v）、提取溶液Ⅲ：乙腈/水（90/10，v/v）、提取溶液Ⅳ：乙腈/水（80/20，v/v），分别提取加标样品中的伏马毒素，实验结果以样品中3 种伏马毒素的加标回收率来比较提取溶液效果。

图1 4种提取溶液对伏马毒素回收率的影响

结果如图1所示，提取溶液Ⅲ∶乙腈/水（90/10，v/v）的提取效果最优，样品加标回收率最高，这可能与伏马毒素的极性化合物性质有关，在此比例的提取溶液条件下，目标物在提取液中的分配系数高。且实验中提取溶液Ⅲ与试样比为2∶1（mL：g）时，加入盐析剂样品高速均质后不易产生乳浊液，上层提取液易过滤分层，比较适合进行下步的实验方案。

2.1.3 净化剂的优化

QuEChERS 前处理技术常用的净化剂有PSA、GCB、C18、NH2、中性氧化铝、弗罗里硅土、SiO2。本试验考察了不同净化剂以及不同添加量对回收率的影响。结果显示，C18、NH2、弗罗里硅土和SiO2为较优净化剂，如图2所示。

试验还比较了SiO2+C18、NH2+C18和弗罗里硅土+C18共3 种QuEChERS 净化剂组合，以提高目标物的响应值。

结果见图3，试验表明30 mg SiO2+30 mg C18+150 mg MgSO4和30 mg 弗罗里硅土+30 mg C18+150 mg MgSO4两组对FB1、FB2、FB3响应值较高，前者的平均回收率更高，所以本试验选择了30 mg SiO2+30 mg C18+150 mg MgSO4组合作为净化剂。

2.2 流动相的选择

伏马毒素属于极性化合物，因此流动相以水和乙腈作为基础溶剂，为了促进样品的离子化，本实验比较了流动相中加入0.1 %甲酸、0.1 %乙酸和10 mmol/L乙酸铵，对3 种伏马毒素分离效果的影响。结果表明，加入甲酸时的离子丰度最强，因此最终确定在流动相中添加0.1 %甲酸进行梯度洗脱，标准溶液色谱如图4所示。

2.3 质谱条件的选择

用质量浓度为50 ng /mL 的混合标准溶液，对目标物进行一级和二级质谱扫描，并优化质谱参数。依据目标物的分子式和碎片离子信息拟合出理论精确质量数。3 种化合物的质谱分析参数见表1，包括目标物的母离子精确质量数，碎片离子的精确质量数以及去簇电压和锥孔电压参数。

图2 不同净化剂对伏马毒素回收率的影响

图3 经不同净化剂组合处理后3种伏马毒素的回收率比较

2.4 定性方法的确认

在检测过程中，一般以离子对“出峰”即为检出，即为阳性结果，但在实际检测过程中由于基质的复杂和干扰较大，经常会出现假阳性现象，进而影响筛查结果的正确性和筛查报告的严谨性。本研究利用HPLC-MS /MS 的MRM-IDA-EPI 监测模式，使伏马毒素在出峰时，一旦响应超过预设的数值，便自动触发增强子离子扫描模式( EPI)，能够得到更低浓度化合物的二级质谱图，该谱图与标准品的谱图比对，可进行更准确的阳性判别。

图4 伏马毒素标准物质色谱图

表1 3种伏马毒素的多反应监测扫描模式的质谱参数

2.5 方法的线性范围与灵敏度

在乙腈-0.1%甲酸流动相体系中，以梯度洗脱的步骤，按1.3.4 实验步骤配制3 种伏马毒素的标准溶液，绘制标准曲线。结果表明:3 种伏马毒素在1.0 ng/mL ～50.0 ng/mL 内均具有良好的线性关系，线性方程分别为：FB1,Y=3125X＋696，FB2,Y=2373X＋764，FB3,Y=1784X-632；采用在空白基质中添加目标组分的方法，计算得到3种伏马毒素的LOD均为0.3～0.5 μg/kg，LOQ 为1.0～1.5 μg/kg，结果见表2。

表2 3种伏马毒素的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限

2.6 方法的精密度、重复性与回收率

在加标回收实验中，选用大麦基质、薏仁基质、燕麦基质、玉米基质4 种空白基质的样品，分别添加10 μg/kg、50 μg/kg 和100 μg/kg、中、高的三个水平混合标准品，每个结果测定5 次，进行加标回收的试验。

由表3 可见，在4 种不同的谷源性基质样品中，3种伏马毒素(FB1、FB2、FB3)的回收率为84.2%～104%，精密度为2.11%～5.02%，说明本实验的检测数据的准确度和精密度可行。

表3 方法的回收率及相对标准偏差(n=5)

3 结 论

本文建立了一种QuEChERS-HPLC-MS /MS检测谷物酸奶中3 种伏马毒素的分析方法。实验结果表明，样品经乙腈/水（90/10，v/v）进行提取后，经30 mg SiO2+30 mg C18+150 mg MgSO4组合净化剂处理后，可有效去除谷物酸奶中的干扰物对目标峰的影响，实现对3 种伏马毒素的净化，在质谱检测器MRM-IDA-EPI 监测模式下，可实现同时对谷物酸奶中FB1、FB2和FB33 种伏马毒素的定性和定量分析。在4 种不同谷源性酸奶基质中的加标回收率为84.2%～104%之间，相对标准偏差(RSD) 在2.11%～5.02%之间，所建立的方法具有可靠的准确度和精密度，能准确快速有效地检测谷物酸奶中的3 种伏马毒素的含量，可为谷物酸奶中FB1、FB2和FB3的分析和监控提供技术支持。