乳清蛋白变性率测定方法研究进展

邵晓园，李高聪，卢兴，彭丽，佟贵山，张军

（1.黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心哈尔滨150500；2.黑龙江大学生命科学学院黑龙江省普通高校分子生物学重点实验室哈尔滨150080；3.双城市君宇奶牛养殖有限公司哈尔滨150131）

0 引 言

乳清蛋白的变性会对乳制品产品品质产生重要的影响。生产酸奶时，杀菌处理会导致部分乳清蛋白变性，改变酸奶的硬度、黏度和组织状态，还可通过防止乳清析出，从而改善酸奶的品质，与酸奶的质量具有显著的相关性[3-5]。在消毒奶生产过程中，乳清蛋白变性会使一些营养成分损失，如免疫球蛋白免疫活性丧失、过氧化物酶活性丧失，降低了蛋白质的营养价值[6]。生产干酪时，热处理温度升高，乳清蛋白变性率增加，一方面会提高奶酪产量，另一方面也会提高奶酪的营养价值[7]。乳清蛋白变性程度会严重影响乳制品中营养成分的生物利用，从而影响乳制品的品质。因此，完善乳清蛋白变性率测定方法是极为重要和必要的，对提高我国乳品质量具有非常重要的意义。

1 乳清蛋白变性的机理

乳清蛋白变性是指蛋白质特有的二级、三级结构的变化，是原来多肽链因外界因素疏松或打开，其一级结构中共价键连接的肽链完好，并未发生断裂[8]。蛋白质变性过程包括两个阶段：第一，当外界温度达到60 ℃时，原本多肽链的折叠结构疏松或打开，导致变性反应发生；第二，多肽链打开后变得越发活跃，容易与其他乳清蛋白或者是酪蛋白胶粒结合[9]。例如：β-Lg 在发生变性时，随着其三级结构展开，使得-SH暴露在外。由四个二硫键连接的α-la 在发生变性时，Cys6-Cysl20 之间的二硫键最先被破坏[10]。热处理是使乳清蛋白发生变性的重要因素，此外pH 值、离子强度、基质等也都会导致乳清蛋白变性[11]。

2 乳清蛋白变性率测定方法

乳清蛋白变性率测定的基本原理是测定变性前、后乳清蛋白质含量差，通过含量差占变性前含量的百分比求得。可见，其可靠性及方便性完全取决于乳清蛋白质的测定方法。

2.1 凯氏定氮法（国标法）

凯氏定氮法的基本原理是：通过测定物质中的氮含量来估算物质的总蛋白质含量。它于1833 年由丹

麦化学家凯道尔提出。目前国标使用凯氏定氮法来测定乳清蛋白变性率，首先是将乳样离心去除脂肪，再用1 mol/L 的HCl 离心去沉淀，所得的上清液（未变性的乳清蛋白溶液）加催化剂反应、蒸馏，馏出液内加硼酸后使用盐酸滴定，根据消耗酸的量计算未变性乳清蛋白含量，利用原料乳与热处理乳的乳清蛋白含量之差计算变性率[12]。计算公式如下：

凯氏定氮法整个实验需要的时间非常长、实验操作复杂、试剂消耗量大、只能测定样品中的总蛋白质，不能测定单一蛋白成分，不能进行大批量样品测定[13]。但是因其测定结果准确，稳定，可作为蛋白质含量检测的标准，用以验证其他检测方法的准确性。

2.2 色谱法

2.2.1 快速蛋白液相色谱法（FPLC）

1985 年Manji[14]提出了快速蛋白液相色谱法（Rapid Protein Liquid Chromatography，FPLC），用于测定乳清蛋白变性。其原理是：乳清蛋白中的每一种蛋白经FPLC 分离后，在280 nm 处测定吸光度值（OD值），根据OD 值计算蛋白质浓度，经热处理后未变性乳清蛋白浓度会发生变化，在热处理后各种乳清蛋白标准峰面积（SPA）和原料乳中乳清蛋白的SPA 比较，就可得出乳清蛋白变性率。计算公式参照公式（1）。FPLC 法重复性好，且迅速方便，能定性定量测定每一种乳清蛋白的变性率，克服了凯氏定氮法仅能测定蛋白变性总量的缺点[15]。

2.2.2 反高效液相色谱法（RP-HPLC）

反高效液相色谱法（RP-High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）可以对乳中未变性的乳清蛋白进行分离并定量测定。基本方法为原料乳或加热乳经离心脱脂后，用1 mol/L HCl调节pH 至4.6 沉淀酪蛋白和变性的乳清蛋白，经离心或过滤除去沉淀后得到未变性乳清蛋白，再经0.45 μm 尼龙膜过滤，即可上样测定。乳清蛋白变性百分数的计算和FPLC 法相同。王浩等人[16]使用RP-HPLC 对牛奶及其乳制品中7 种蛋白成分进行分离，解决了乳制品加工后变性蛋白含量测定不准确的问题。朱鑫鑫[17]等人用此方法来测定不同乳样中未变性乳清蛋白含量，结果表明此方法能将4 种乳清蛋白分离并且定量准确，适合应用于乳清蛋白的定量和定性。 RP-HPLC 与凯氏定氮法相比较准确、快速，但所需标准品和仪器价格昂贵，检测成本较高。

2.3 分光光度法

2.3.1 双缩脲法

双缩脲法的原理是：脲在180 ℃时脱氨生成双缩脲，与Cu2+形成紫红色复合物，颜色深浅与蛋白含量在一定范围内成正相关，对乳清蛋白样品的吸光度值进行检测，与标准曲线进行对比便可找出蛋白质的浓度[18]。在检测原料乳和热处理乳的乳清蛋白含量的基础上，通过差量法得到变性的乳清蛋白量，从而得到乳清蛋白变性率。路纯明[19]等人采用正交实验优化了双缩脲法的测定条件，进而测定酸奶、牛奶中蛋白质含量，结果表明该方法测定结果准确，且与凯氏定氮法的相对误差仅为3%。王振华[20]等人在双缩脲法的基础上添加过滤步骤，对牛乳中未变性乳清蛋白进行测定，结果表明该方法精确度、准确度、回收率等均较高。双缩脲法测试时间短，过程操作简单，可大批量测定，但同时也存在准确度、灵敏度较差，测定蛋白质范围只有1～20 mg 等缺点[21]。

2.3.2 考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝法的基本原理是：考马斯亮蓝（G-250）溶液与乳清蛋白反应生成蓝色复合物，测定乳样品在595 nm 处的OD 值，与标准曲线进行对比便可找出蛋白质的浓度[22]。1976 年Bradford[23]首次提出了使用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，在检测原料乳和热处理乳的乳清蛋白含量的基础上，通过差量法得到变性的乳清蛋白量，从而得到乳清蛋白变性率。聂昌宏[24]等用此方法对牛乳中未变性乳清蛋白和总蛋白含量进行了测定，结果表明在0.005～0.1 mg/mL 范围内的OD 值线性关系（r=0.9995）良好，RSD 为2.03%，验证了该方法可以对未变性乳清蛋白和总蛋白进行准确测定。考马斯亮蓝法灵敏度高，检测下限达1 ug 左右，测定过程需要的时间短，操作简便，而且稳定性比较好。

2.3.3 Lowry法

1921 年Folin 创造了Folin－酚试剂法来测定蛋白质，但该法灵敏度低[25]。1951 年，Lowry 改进Folin 法，发现在碱性环境下，肽键与Cu2+形成的螯合物与Folin试剂可产生蓝色混合物，其颜色深浅与蛋白质含量正相关[26-27]，通过测得的O.D 值计算含量。Lowry 法具有操作简单、灵敏度高的优点，缺点是受多种因素干扰，需要购买试剂盒，需要的资金多，不适应于大批量样品测定[28]。

2.3.4 二喹啉甲酸法（BCA）

二喹啉甲酸法的基本原理是：蛋白质与BCA 试剂可生成有色化合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，在562 nm 下测定其吸光度值，根据试样的吸光度值在对应的标准曲线上找出对应的蛋白质浓度[29]。在检测原料乳和热处理乳的乳清蛋白含量的基础上，通过差量法得到变性的乳清蛋白量，从而得到乳清蛋白变性率。BCA 法的抗干扰能力明显强于凯氏定氮法，灵敏度高，检测下限达0.5 ug[1，30]。此外，BCA 法具有速度快、结果准确、操作简单、所用试剂较少、分析成本低廉等优点。

2.4 其他方法

2.4.1 差示扫描量热法（DSC）

许多研究者应用差示扫描量热法（DSC）研究了乳清蛋白的变性问题[15]。蛋白质的变性焓变通过公式△H=4RTD2-△TD1/2来计算，式中：TD为变性温度，是热吸收峰的半峰宽，R 是气体常数，据此我们可以求得蛋白变性率（%），即：

在测定蛋白质浓度为2%～7%的溶液时，此方法存在重复性差，定量困难的缺点，不适用于在乳品中进行乳清蛋白变性的定量测定。但蛋白质浓度高于10%时，DSC 方法不仅能够得到较为准确的变性温度，而且能得到变性百分比结果[15]。

2.4.2 乳清蛋白氮指数法（WPNI）

乳清蛋白氮指数法（Whey Protein N Index，WPNI）的原理是：通过对浊度（420 nm 下乳清上清液的透明度）的迅速测定，与对应的标准曲线进行对比，再通过计算得到WPNI 值，比较原料乳和热处理乳的WPNI 值得到乳清蛋白的变性率。由1947 年Harland首次提出并经Leighton 等修正后应用于乳清蛋白变性的测定中。王婷婷[31]等人采用在蛋白质溶液中加盐酸导致溶液混浊，利用420 nm 处的吸光度值表征变性程度，结果表明该方法具有测定迅速、方便的优点，但是与凯氏定氮法比较，重复性差误差稍大，不适用于对乳清蛋白变性进行精确测定[32]。

2.4.3 SDS电泳法

SDS 电泳法的基本原理是：十二烷基硫酸钠（SDS）可破坏蛋白质的非共价键，使蛋白质变性[19]。乳清蛋白变性后分子量会发生较大变化，电迁移率也会随之发生较大变化，再通过电泳和光密度扫描，对照原料乳和热处理乳计算乳清蛋白变性率。它由Shapiro[33]于1967 年建立，可用于分离各种蛋白质和核苷酸[34-35]。SDS 电泳法不能对免疫球蛋白进行定性定量测量，因而对总蛋白的测定结果产生影响，另外对仪器设备要求较高，结果需用Bandscan 软件后处理，误差较大，测定所需时间长[36]。

2.5 方法整理对比

以上对常见乳清蛋白测定方法进行了详细介绍，各方法均有其自身特点，现将其优缺点做出整理，如表1所示。

表1 乳清蛋白测定方法比较

3 展 望

乳清蛋白变性率是乳制品加工过程中品质控制的一项关键指标，其测定方法有很多种，凯氏定氮法作为经典方法，测定结果准确，所以GB 5009.5-2010采用此方法，但操作复杂、耗时长，可作为基准检测使用；色谱法，由于可以分离各种蛋白质并进行定量，所以该法针对性更强，但成本很高。比较研究结果显示，色谱法测定速度快，实用价值和应用前景比较明朗，且RP-HPLC 法和FPLC 法都与凯氏定氮法结果有很好的一致性[37]。差示扫描量热法、WPNI 法具有方便、快速的特性，但是测定结果精确度差，应用上受到限制。分光光度法是通过测定样品的吸光度值来计算变性率，操作相对简单且测定时间短，但需要完成显色反应过程，所以显色剂选择成为关键，要求选择性好、灵敏度高（ε＞104）、化学组成和性质稳定、显色剂和产物有明显的颜色差（Δl＞60nm）等条件，因此，对分光光度法的优化及开发有广阔的发展空间，是今后蛋白质测定方法研究的重要方向。