泛素样含PHD和环指域1在结肠癌组织表达阳性率与临床病理参数相关性分析

王 颖

南方医科大学深圳医院肿瘤科，广东 深圳 518000

结肠癌是一种发生率很高的恶性肿瘤，在我国结肠癌的发生率要比国外一些发达国家低，但最近几年，由于人们不良的饮食和生活习惯，结肠癌的发生率呈逐年上升的势头［1-2］。泛素样含PHD和环指域1（UHRF1）在很早之前就已经被研究者发现，其与细胞的生长关系紧密相关，是一种核蛋白基因，参与细胞周期、繁殖和凋亡等一系列人体生化反应，其可结合半甲基化DNA、甲基化组蛋白H3K9，之后再结合DNA生长点，继而将DNA甲基转移酶1（DNMT1）引到生长点对新生链DNA的甲基化过程进行催化，继而保证甲基化谱式遗传的精准度［3-6］。当前UHRF1在结肠癌组织中的表达水平与临床病理参数相关性的研究较少，本文研究旨在对UHRF1蛋白在结肠癌组织中的表达水平进行检测，分析该种蛋白与临床病理参数的相关性，旨在研究这种蛋白与肿瘤转移情况、浸润深度之间的关系，指导结肠癌放化疗方案的制定，现将研究结果报告如下。

1 一般资料

1.1 标本来源

使用上海芯超结肠癌芯片结肠癌HColA150CS02作为研究对象，男性44例，女性31例，年龄在26～83岁，平均年龄为（62.37±12.6）岁，根据美国联合癌症分类委员会（AJCC）制定的TNM分期标准：36例在Ⅰ～Ⅱ期，39例在Ⅲ～IV期；11例处于高分化状态，47例处于中分化状态，17例处于低分化状态。

1.2 实验仪器

彩色全自动图像分析仪、光学显微镜石蜡切片机、捞片机、烤片箱、电磁炉、高压锅、冰箱等。

2 方法步骤

2.1 切片

2.1.1 切片前准备：用洗涤液先将载玻片、盖玻片清洗干净并烘干，之后将载玻片、盖破片分别置于浓硫酸中8～12 h、6 h，将两种破片取出后用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗干净，之后将两种玻片泡于95%的乙醇中，第二天将其取出烘干，放置在盒中备用。为了防止免疫组织染色时切片脱片，在贴片之前，用玻片硅化试剂涂于载玻片上，烘干备用。

2.1.2 石蜡切片制备：用石蜡切片机切片，每片标准厚度为4μm，使用载玻片将切片捞出，置于切片架上，为了防止脱片，将切片放置在温度为人体正常体温的箱内，第二天再取出。

2.2 免疫组织染色

（1）将切片放入烤片机中进行高温烘烤，时间为10～60 min，直至切片上的石蜡被全部烘干。试剂：鼠抗人UHRFl单克隆抗体（1:150稀释，购自美国Abcam公司）；通用免疫组织化学SP试剂盒和DAB显色试剂购自福州迈新生物技术开发有限公司。（2）按下述顺序冲洗：用二甲苯I、二甲苯II各冲洗15 min，100酒精I、100%酒精II各冲洗5 min，95%酒精、90%酒精、80%酒精、50%酒精各冲洗5min，PBS溶液冲洗3次，3min/次。（3）用蒸馏水冲洗，清除残留在切片上的PBS液体，将切片置于高压锅中，加入0.1M枸橼酸盐缓冲液（酸碱值为6.0），直至溶液完全没过切片，加热20min左右直至溶液沸腾，自然冷却10 min左右，之后用PBS每次冲洗切片5 min，共3次。（4）用蒸馏水冲洗，清除残留在切片上的PBS液体，每张切片滴入大约10μL的一抗（UHRF1、DPD和Ki-67），将切片置于冰箱中，4℃冷藏，次日将切片取出，用PBS溶液每次冲洗5 min，总共冲洗3次。（5）用蒸馏水冲洗，清除残留在切片上的PBS液体，每张切片滴入40μL HRP标记过的IgG，人体正常体温下孵育10 min，用PBS冲洗5 min/次，共3次。（6）用蒸馏水冲洗，清除残留在切片上的PBS液体，每张切片滴入现配制的DAB显色剂60μL，室温无光条件下显色，用光学显微镜进行观察，在合适的时间用自来水停止反应（此过程约为2～5 min）。（7）用苏木精染色，重复操作60 s，自来水冲洗，用1%盐酸酒精分化液将组织过多结合的染色剂脱去，1%氨水使苏木素染上的细胞核呈现蓝色，用自来水冲洗。（8）将切片按顺序放于50%浓度酒精、80%浓度酒精、90%浓度酒精、95%浓度酒精中各脱水5 min，用100%酒精I、100%酒精II各脱水10 min，二甲苯I、二甲苯II各透明10 min，采用中性树胶粘合剂进行封片。

阴性对照：用免疫组织染色方法进行染色的切片；阳性对照：用已知的结肠癌阳性组织切片。每个切片同时设置阴性和阳性对照。

2.3 试验结果判定

由两名经验丰富的医师在不知情的情况下对各组染色切片进行观察并判断。观察：每个切片随机选择高倍镜（×100）下的5个视野，每个视野计细胞数200个。判断：UHRF1大多染色于胞质和胞膜，阳性染色的细胞占比为0，则为0分，阳性细胞＞0～25%计为1分，阳性细胞≥25%～50%计为2分，阳性细胞≥50%～75%计为3分，阳性细胞≥75%计为4分。无阳性染色为0分，呈现浅黄色为1分，在浅黄色与棕黄色间为2分，呈现深黄色为3分。最终分数为上述两项的乘积，阴性（-）记为0分，弱阳（+）记为1～4分，中阳（++）记为5～8分，强阳（+++）记为9～12分。

2.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，三种蛋白的表达阳性率为计数资料，采用χ2检验，各指标的相关性分析采用Pearson分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 UHRF1蛋白在结肠癌组织与正常结肠组织中的表达

UHRF1高表达于胞质和胞膜，UHRF1蛋白结肠癌组织中的阳性表达率为64.00%（48/75）高于正常结肠组织中的阳性率表达28.00%（21/75），差异有统计学意义（χ2=19.57，P＜0.05）。

3.2 UHRF1蛋白在结肠癌组织中的表达与临床病理参数的关系

UHRF1蛋白结肠癌组织中的表达情况均与患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度的临床病理参数不存在相关关系，差异无统计学意义（P＞0.05），与浸润深度、TNM分期、是否发生淋巴结转移存在相关性，浸润深度与TNM分期呈负相关关系，肿瘤发生转移，UHRF1蛋白的阳性表达率会随之升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 UHRF1在结肠癌组织中的表达与临床病理参数的关系

4 讨论

UHRF1蛋白高表达于增值分裂的细胞，但在处于静止状态的细胞却呈现出低表达状态［7-8］。本实验采用免疫组化的试验方法，实验结果显示UHRF1在结肠癌组织中的表达显著高于正常组织，UHRF1的表达与浸润深度、TNM分期呈正相关关系，UHRF1在发生转移的结肠癌组织中其阳性表达率比未发生转移的高，证明了UHRF1在结肠癌组织中的表达与淋巴结转移情况相关。

本文实验采用免疫组化的方法，分析UHRF1蛋白在结肠癌组织中表达间的关系，发现UHRF1蛋白结肠癌组织的阳性表达率均显著高于正常结肠组织的阳性表达率，UHRF1蛋白结肠癌组织的表达情况与浸润深度、TNM分期具有正相关性，UHRF1蛋白在发生转移的结肠癌组织中阳性表达率均高于未发生转移者，说明UHRF1蛋白与结肠癌的产生、发展及预后息息相关。综上所述，UHRF1对提升结肠癌患者的临床诊断敏感度具有一定的价值，可指导放疗、化疗方案的制定以及预后情况的判断。