麦蚜及植物病毒胁迫下小麦体内保护酶和解毒酶活性的变化

张 弛，孟琳钦，苏 丹，仝则乾，胡祖庆

(旱区作物逆境生物学国家重点实验室，西北农林科技大学植物保护学院，陕西杨凌712100)

小麦(TriticumaestivumL.)是中国主要粮食作物之一，其产量和品质直接影响国家粮食生产安全。小麦生长过程中常受到病毒病和麦蚜的危害。大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus，BYDV)在中国主要有4种株系，即GAV、PAV、RMV和GPV，其中GAV株系是引起中国小麦黄矮病的主流株系，可造成小麦植株矮化、叶片倒V字黄化，小麦黄枯后，受害植株下部叶片仍呈绿色[1]，是目前中国北方麦区的主要病毒病。麦蚜，属半翅目蚜科(Hemiptera:Aphididae)，以刺吸小麦汁液，影响光合作用，还可传播小麦病毒病，间接影响小麦生产[2]。中国常见的麦蚜有麦二叉蚜(Schizaphisgraminum)、禾谷缢管蚜(Rhopalosiphumpadi)和麦长管蚜(Sitobionavenae)，麦二叉蚜和麦长管蚜是大麦黄矮病毒BYDV-GAV株系的传毒介体[3]。在田间，BYDV-GAV和3种蚜虫往往同时发生，因此亟需研究BYDV-麦蚜-小麦三者的互作关系，为指导小麦生产中蚜虫和BYDV-GAV的综合治理提供帮助。

植物的生长发育常受多种生物的侵扰胁迫，植物病毒和介体昆虫是其中影响较大的两类。寄主植物受病毒侵染后，其正常生理代谢进程被干扰，表现为植物生长受阻，产量和品质降低，因此植物病毒病又被称为“植物癌症”[4]。植物病毒与寄主植物之间存在明显的相互作用，植物病毒侵染植物后，可导致寄主植物的形态特征发生改变，主要表现为叶片变异、组织坏死和畸形[5]；体内的挥发性物质(volatile organnic compound，VOC)的种类与含量也会发生改变[6-7]；此外，寄主植物感染病毒后，体内的氨基酸、碳水化合物等营养成分也会受到影响[8]。媒介昆虫取食能影响寄主植物的生理状态，如应对刺吸式昆虫取食，植物具有闭塞筛管的功能[9]，此外寄主植物还能提高防御信号物质(如水杨酸、茉莉酸、活性氧等)的含量并激活相应防御途径以抵御昆虫的胁迫[10-11]。与病毒胁迫相似，受媒介昆虫危害后，寄主植物也会调节体内防御性次级代谢产物的生成和释放[12]。寄主植物在长期的进化过程中，形成和构建了应对多种胁迫的防御系统和反应机制，其中，活性氧在寄主植物应对外源病毒侵染和植食性昆虫取食过程中发挥了重要作用[13]。细胞外，活性氧具有直接杀死病菌的功能，而在细胞内则通过发挥信号传递功能来启动植物体内防卫基因的表达，活性氧过多时，植物的细胞结构会受到不可逆的损伤，最终死亡。植物体内存在超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)等活性氧清除酶系[14]，可避免过多的活性氧对植物造成损害；植物体内还存在酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)等解毒酶以应对病毒和媒介昆虫的胁迫。ACP具有诱导活性，其活性受植物供磷状况的影响，通过将环境中的有机磷降解为植物体可吸收的磷酸盐和焦磷酸来供给植物营养[15]。目前，病毒和媒介昆虫对植物的影响主要集中在植物受胁迫后体内挥发物和营养成分的变化等方面，而对植物体内保护酶系和解毒酶系活性的影响尚不明确。鉴于此，本研究以麦二叉蚜、禾谷缢管蚜和麦长管蚜为试虫，以BYDV-GAV为测试病毒，分析蚜虫、植物病毒及两者共同胁迫下小麦体内保护酶系和解毒酶系的活性变化规律，以期为探究蚜虫-病毒-小麦三者间的互作关系奠定基础，为蚜虫和BYDV-GAV的综合治理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试小麦

供试小麦品种为矮抗58，来自陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室。采用盆栽试验，试验用盆为PVC塑料盆，直径9 cm，高8 cm。播种前用清水将小麦种子浸泡24 h，随后将4～5粒种子撒入装有2/3体积育苗基质的PVC塑料盆中，最后再覆盖1/3体积的育苗基质。用喷壶喷水至浸透育苗基质，播种后，用透明塑料笼罩(顶端带有纱网)罩住塑料盆，放入人工气候箱(温度25 ℃，相对湿度60%，光周期14L∶10D)培育，待小麦长至一心一叶期时备用。

1.1.2 供试毒源

在西北农林科技大学北校区试验农场麦田(34°17'18.8"N，108°04'06.0"E)显症的小麦植株上采集麦二叉蚜，通过RT-PCR方法进行BYDV株系鉴定，BYDV-GAV、BYDV-PAV和BYDV-GPV 3种株系的鉴定引物设计均参考刘双清[16]的方法，确认麦二叉蚜体内仅含有GAV株系后，放入人工气候箱内单头长期饲养。蚜虫和植物每隔2～3代后，均进行BYDV-GAV、BYDV-PAV和BYDV-GPV 株系的检测，以确保存在仅感染大麦黄矮病毒GAV株系。

1.1.3 供试虫源

采集地点同1.1.2。单头采集麦二叉蚜、禾谷缢管蚜和麦长管蚜，每采集点相隔至少5 m，采集后在人工气候箱内单头饲养10代以上形成单克隆系，进行RT-PCR鉴定(鉴定方法同1.1.2)，确保其体内不含BYDV任何株系后备用。

1.1.4 主要仪器和试剂

Infinite M200全波长酶标仪，瑞士Tecan公司；BIC-300人工气候箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。POD过氧化物酶试剂盒、CAT过氧化氢酶试剂盒、SOD超氧化物歧化酶试剂盒、ACP酸性磷酸酶测试盒和AKP碱性磷酸酶测试盒，均生产自南京建成生物工程研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

(1)麦蚜影响小麦酶活性试验。小麦长至一心一叶期后，每盆保留3株小麦，接入30头(每株10头)24 h内初生的无毒麦二叉蚜/禾谷缢管蚜/麦长管蚜作为麦二叉蚜处理组(Sg1)/禾谷缢管蚜处理组(Ra1)/麦长管蚜处理组(Sa1)，不接种蚜虫的健康小麦作为对照组(CK1)。待长至成蚜后，剔除所接蚜虫，分别收集花盆中的3株小麦，每株剪叶片2～3段，每段3～4 cm，将采集的叶片进行下一步的酶活测定。每个处理重复3次。

(2)BYDV影响小麦酶活性的试验。小麦长至一心一叶期后，每盆保留3株小麦，处理组(BYDV)每盆接入15头(每株5头)携带BYDV-GAV株系麦二叉蚜3龄若蚜，对照组(CK2)接入无毒麦二叉蚜3龄若蚜。处理72 h后，剔除所接蚜虫，并分别收集花盆中的3株小麦，每株剪叶片2～3段，每段3～4 cm，通过RT-PCR鉴定确认处理组3株小麦均含有BYDV-GAV病毒后，将采集的叶片进行下一步的酶活测定。每个处理重复3次。

(3)蚜虫与BYDV病毒共同影响小麦酶活性的试验。通过接种携带BYDV-GAV株系麦二叉蚜3龄若蚜的方法获得带毒小麦，每盆保留3株小麦，每盆接入30头(每株10头)24 h内初生的无毒麦二叉蚜/禾谷缢管蚜/麦长管蚜若蚜作为麦二叉蚜处理组(Sg2)/禾谷缢管蚜处理组(Rp2)/麦长管蚜处理组(Sa2)，选择感染植物病毒但未受蚜虫胁迫的小麦作为空白对照组(CK3)，待30头若蚜均长至成蚜后剔除，分别收集小麦，每株剪叶片2～3段，每段3～4 cm，通过RT-PCR鉴定，确认处理组3株小麦均含有BYDV-GAV病毒后，将采集的叶片进行下一步的酶活测定。每个处理重复3次。

1.2.2 酶活测定方法

取经过处理的新鲜叶片0.2 g与无菌0.9%生理盐水(测SOD活性需加等量的PBS缓冲液)按质量∶体积=1∶9的比例混合并加入少量石英砂，在冰上迅速将叶片研磨成匀浆液，转入离心管4 ℃ 2 500 r·min-1离心10 min，上清液即为酶原液。所有酶活性均按照南京建成酶活试剂盒的方法进行测定。

1.3 数据处理

用Microsoft Excel软件分析整理数据，计算酶活性；用SPSS 20.0 软件对酶活数据进行单因素方差分析，Tukey法(P=0.05)进行多重比较，数据用“平均数±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 3种麦蚜对小麦体内主要保护酶和解毒酶活性的影响

由表1可知，与不接种蚜虫的健康小麦(CK1)相比，麦二叉蚜处理组(Sg1)小麦体内的POD活性无显著差异，禾谷缢管蚜处理组(Rp1)小麦体内的POD活性显著下降，降幅为 34.59%，麦长管蚜处理组(Sa1)则显著上升，增幅为83.88%；Sg1和Rp1小麦体内CAT、SOD和AKP活性均与CK1无显著差异，而Sa1小麦体内CAT、SOD和AKP活性则均显著上升，增幅分别为91.21%、126.45%和468.82%；Sg1和Sa1小麦体内ACP活性均显著高于CK1，增幅分别为100.46%和197.26%，而Rp1则无显著差异。

表1 不同麦蚜处理组健康小麦体内保护酶和解毒酶的活性

2.2 BYDV对小麦体内主要保护酶和解毒酶活性的影响

由表2可知，与未感染植物病毒的小麦(CK2)相比，感染BYDV-GAV病毒(BYDV)的小麦体内，POD、CAT、ACP和AKP活性均无显著差异，SOD酶活性则显著上升，增幅达 37.41%。说明BYDV病毒对小麦体内POD、CAT、ACP和AKP活性无明显影响，但能导致小麦体内SOD活性显著增加。

表2 感染与未感染病毒处理组小麦体内保护酶和解毒酶的活性

2.3 麦蚜对感染BYDV-GAV小麦体内主要保护酶和解毒酶活性的影响

由表3可知，与感染植物病毒但未受蚜虫胁迫的小麦(CK3)相比，麦二叉蚜处理组(Sg2)、麦长管蚜处理组(Sa2)和禾谷缢管蚜处理组(Rp2)小麦体内的CAT活性均显著上升，增幅分别达110.72%、115.13%和70.19%；Sg2、Rp2和Sa2的SOD活性均与CK3无显著差异；Sg2和Sa2小麦体内POD活性显著高于CK3，增幅分别达73.66%和97.58%，Rp2与CK3则无显著差异；Sg2和Rp2小麦体内ACP活性显著高于CK3，增幅分别为50.49%和37.00%，Sa2与CK3则无显著差异；Sa2小麦体内AKP活性显著高于CK3，增幅达3 665.03%，Sg2和Rp2与CK3则无显著差异。

表3 不同麦蚜处理下感染BYDV小麦体内保护酶和解毒酶的活性

3 讨 论

植物为应对植食性昆虫的胁迫，体内会产生活性氧(ROS)作为信号转导物质，诱导植物产生次生代谢物质，而SOD、CAT和POD组成的保护酶系可以清除过多的ROS，保护植物细胞膜的结构[17-19]，因而保护酶系的活性变化可作为观察指标，以确认植物是否对外界胁迫产生了诱导防御反应，从而判断植物对某种昆虫的抗性强弱以及昆虫对寄主植物的适合度[20-21]。

吴龙火等[17]和苟长青等[21]分别研究了害虫胁迫下植物山羊草和苜蓿体内的保护酶系变化规律，均发现植物对不同种类害虫的防御反应具有差异性，本研究表明，小麦对麦长管蚜的防御反应强度高于麦二叉蚜和禾谷缢管蚜，也得到了类似的结论。本研究也从侧面印证了实际观察中发现的麦长管蚜在小麦苗期时比禾谷缢管蚜和麦二叉蚜的适合度低这一现象，其具体机制则需进一步研究确定。与未感染病毒的植物相比，BYDV-GAV胁迫下，小麦体内SOD活性显著升高，可能是因为病毒侵染使小麦体内超氧自由基含量上升，过量的超氧自由基则刺激SOD酶活性提高以抑制细胞膜质过氧化作用，这与玉米对矮花叶病毒[14]及棉花对红腐病菌[22]的防御反应表现一致。

在田间，植物病毒与害虫往往同时发生，两者的互作关系会对小麦体内的生化防御产生影响，到目前为止此类研究还未见有报道。本研究分析了BYDV-GAV存在条件下麦蚜对小麦体内保护酶活性的影响，结果表明，与感染BYDV-GAV但未受蚜虫胁迫的小麦相比，麦二叉蚜与麦长管蚜胁迫下小麦体内的POD、CAT活性均显著升高，禾谷缢管蚜胁迫下仅有CAT活性显著上升，推测这可能是因为在病毒存在条件下，麦蚜的取食危害使得小麦体内的H2O2含量急剧升高，小麦需要提高POD和CAT活性或者合成更多的酶来降解，而H2O2升高的原因与SOD催化超氧自由基产生H2O2与O2是否有关则需进一步的研究验证。

磷酸酶是一种能将有机磷分解为植物体直接吸收的无机磷的水解酶，ACP与AKP的区别在于：ACP需在酸性条件下参与催化反应，而AKP则具有非特异性[23-24]，植物体内二者活性受到植物供磷状况的影响，可作为植物面对磷胁迫的变化指标，以判断植物对磷的利用情况[25-26]。本研究表明，麦长管蚜和麦二叉蚜取食使小麦出现低磷胁迫，需提高磷酸酶的活性以应对低磷胁迫，而禾谷缢管蚜取食、BYDV-GAV侵染不会对小麦造成磷胁迫。但在BYDV-GAV存在条件下，麦长管蚜、麦二叉蚜和禾谷缢管蚜均能使小麦出现低磷胁迫，这可能是因为禾谷缢管蚜与BYDV-GAV联合胁迫对小麦产生了不良影响，使其出现低磷胁迫。

在农田生态系统长期进化过程中，大麦黄矮病毒(BYDV)-介体麦蚜-小麦三者间形成了复杂的互作关系。本研究仅在室内控制条件下分析了BYDV和麦蚜胁迫下小麦体内的保护酶和解毒酶活性，其变化规律还有待在农田生态系统中进行进一步验证。此外，有必要在此研究基础上进一步利用转录组学的方法研究小麦体内保护酶和解毒酶的基因表达量，为明确小麦抗性生化机理和防御反应机制奠定基础，从而了解小麦应对不良环境胁迫时的基因适应机制。