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抗赤霉病小麦优异新种质的分子标记辅助选择

2020-07-31李静静史娜溶杨孟于王金鹏孙道杰张玲丽

麦类作物学报 2020年3期
关键词:等位品系赤霉病

李静静,史娜溶,杨孟于,王金鹏,孙道杰,冯 毅,张玲丽

(西北农林科技大学农学院,陕西杨凌 712100)

赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是小麦生产中具有毁灭性的病害,近10年来在中国黄淮麦区大面积流行[1-3]。赤霉病主要危害小麦穗部,严重影响产量,感病籽粒含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)等毒素,食用或饲用后会引发中毒[4],直接威胁粮食安全和食品安全。抗赤霉病新品种的选育及其推广利用是控制病害发生和蔓延的最经济有效的措施[1]。在中国黄淮麦区以往的小麦育种中,赤霉病抗性未被作为主要育种目标[5],致使目前大田主要推广品种的赤霉病抗性普遍较差[6]。赤霉病免疫或高抗种质资源在全世界较为稀缺[7],因此,创制抗赤霉病新种质是当前黄淮麦区抗病育种的主要育种目标[2]。在国内外研究的40多个抗赤霉病种质资源材料中,中国小麦地方品种苏麦3号是目前全世界公认的高抗赤霉病优异种质资源[7]。苏麦3号含有多个抗赤霉病的QTLs,分别位于3BS、5AS和6BS等染色体上[7-8],其中,位于3BS染色体上的主效基因Fhb1(即Qfhs.ndsu-3BS)[9-10]抗扩展效应最强,被广泛研究和利用[5,7],该基因可解释表型变异的24.5%~60.0%[11-13];已开发的Fhb1基因连锁标记有gwm533、gwm493、barc133、umn10和barc147等[10,14-17]。位于苏麦3号6BS染色体上的抗赤霉病微效基因Fhb2可解释赤霉病抗性表型变异的 9.4%~21.0%[15,18],该位点开发的可利用标记有gwm133、barc101和gwm644[11,15,18]。位于5AS染色体臂上的基因Fhb5(即Qfhi.nau-5A)与抗赤霉病菌侵染密切相关[19],可解释赤霉病抗性表型变异的20.0%左右[14],已开发的连锁标记有barc186、barc180、gwm304、wmc705、gwm293和gwm154[12,14,20-21]。位于苏麦3号3BS、5AS和6BS染色体上的这些抗赤霉病基因分子标记,可用于抗病育种的分子标记辅助选择[7]。但是,苏麦3号春性较强,易受冻害;株高120 cm左右,茎秆纤细易倒伏,农艺性状差,产量低;籽粒粉质,品质较差[22-23],在黄淮冬麦区直接利用难度较大[5]。

小麦新品系979-5是从黄淮麦区主推品种西农979中系选的矮秆品系,株高(75 cm左右)较西农979低,抗倒伏,具有西农979的早熟抗寒和优质强筋特性,但中感赤霉病。为此,本课题组通过979-5与苏麦3号杂交组合,采用系谱育种法,结合利用分子标记辅助选择技术和赤霉病菌接种鉴定技术,选育兼抗赤霉病的优良育种材料,以期为黄淮麦区抗赤霉病小麦新品种改良提供优异亲本材料。

1 材料与方法

1.1 材 料

本课题组于2012年以979-5与苏麦3号为亲本进行杂交,2013年田间种植F1群体,2014年在F2代群体中选择优良单株,2015-2019年分别种植F3~F7并从中选株系。每年同步种植对照材料矮抗58(高感赤霉病),亲本材料979-5(中感赤霉病)和苏麦3号(高抗赤霉病)。参试材料于每年10月5日播种于西北农林科技大学小麦育种试验田:F1种植106株,F2种植12 420株,F3~F7每个株系种植3行。播种规格:株距6.67 cm,行距27.0 cm,行长200 cm。小麦生长期间不进行病害防治,其余管理同大田。

所用赤霉病病原菌菌种分离自陕西关中灌区田间禾谷镰刀菌强致病菌系,在灭菌的小米粒上扩繁,菌种由西北农林科技大学植物保护学院王保通教授惠赠。

1.2 方 法

1.2.1 主要农艺性状调查

调查的主要农艺性状有幼苗抗寒性、株高、开花期、成熟期、单株成穗数、穗长和小穗数等。在植株生长发育期间,进行观察记载,并对性状表现优异单株挂牌标记。

1.2.2 赤霉病接种和病情鉴定

于小麦扬花期,将培养好的带菌米粒接种于麦穗中上部第4或第5个小穗(从穗顶部往下数)最外边的一个小花内。接种后,立即用装有蒸馏水的喷壶喷湿接种穗,并用塑料袋套袋保湿 72 h。单株鉴定时,每个单株接种3个单穗;品系鉴定时,每个品系随机接种20个单穗。

参照中国小麦抗赤霉病评价技术规范[24],于接种21 d后,调查每个接种穗部的发病小穗数和总小穗数,计算严重度。依据平均严重度,将材料可分为5个抗性等级:免疫(I)(平均严重度为0),高抗(HR)(0 <平均严重度< 2.0),中抗(MR)(2.0 <平均严重度≤3.0),中感(MS)(2.0<平均严重度≤3.5),高感(HS)(平均严重度 ≥3.5)[24]。

1.2.3 DNA标记分析

取苗期小麦幼嫩叶片,按照Edwards等[25]的CTAB法提取基因组DNA。选用与苏麦3号抗赤霉病基因Fhb1、Fhb2和Fhb5紧密连锁的13个SSR标记进行分析,即:3BS上Fhb1的4标记(gwm493、barc133、gwm533和barc147)[11,16,26],6BS上Fhb2的3个标记(gwm133、gwm644和barc101)[19],5AS上Fhb5的6个标记(barc186、barc180、wmc705、gwm293,gwm154和gwm304)[12,14,21,27]。引物由北京迪宁生物科技有限公司合成。

PCR反应总体系为15 μL,包括:1.5 μL 10× PCR buffer,0.3 μL dNTPs Mixture(10 mmol·L-1),0.4 μLTaqDNA聚合酶(2.5 U · μL-1),2 μL引物(上、下游引物各1 μL,5 μmol·L-1),2 μL模版DNA(50 ng·μL-1),8.8 μL dd H2O。PCR反应扩增程序为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性1 min,55~60 ℃退火 1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃后延伸 10 min,4 ℃保存。PCR扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

1.2.4 籽粒品质分析

收获的籽粒晾晒干燥并室内常温贮藏1月后,利用近红外透射谷物分析仪(型号InfratecTM 1241,福斯有限公司,中国)测定籽粒含水量、蛋白质含量(干基)、湿面筋含量(14%水分基)、面粉吸水率、面团稳定时间和沉降值等指标。

通过一年的肥效对比试验数据积累、比较可以看出:肥料合理配比和提高肥料利用率是作物高产稳产的关键,使用配方专用肥是解决这一问题的有效手段,同时可以改善土壤养分供给,满足作物对养分的需求,从而达到增产增收的目的,因此,建议在今后的生产中应推广专用配方肥[2]。

1.2.5 数据处理与分析

利用SPSS 19.0数据统计分析软件进行方差分析和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 分子标记在两亲本间的多态性

选用13个SSR标记对亲本979-5和苏麦3号进行扩增分析,其中6个标记(3BS上的gwm493,6BS上的gwm133和gwm644,5AS上的gwm293、barc186和gwm304)在两亲本间扩增为单态(图1A),其余7个标记(3BS上的barc133、gwm533和barc147,6BS上的barc101,5AS上的barc180、wmc705和gwm154)在两亲本间扩增均为多态(图1B)。这表明,979-5与苏麦3号在3BS、6BS和5AS三个抗赤霉病基因位点具有一定的遗传相似性。因此,选用7个多态性标记可对979-5和苏麦3号的后代群体的3个抗性基因位点进行选择。

2.2 抗赤霉病新品系创制结果

采用系谱育种法,从12 420个单株组成的F2代群体中,依据农艺性状表现选到545个优良单株。按株系种植F3~F5世代群体,根据农艺性状表现,在优良株系内选择优良单株,对初选单株用3BS上的3个多态性标记(gwm533、barc133和barc147)分别进行分析(图2A),发现这3个标记位点均能扩增出与苏麦3号相同带型的单株。经2018和2019年连续两年标记检测和农艺性状分析,最终育成稳定遗传且含有3BS上Fhb1基因标记位点的新品系20个(表1)。

2.3 新品系在5AS和6BS标记位点的差异

用5AS上的多态性标记(barc180、wmc705和gwm154)和6BS上的多态性标记(barc101)(图2B,C),分别对育成的14个新品系进行分析。结果发现,有5个品系(k11、k12、k13、k14和k15)在三个标记位点(wmc705、gwm154和barc101位点)检测到苏麦3号的特异条带;有2个品系(k9和k10)在两个标记位点(wmc705和gwm154位点)检测到苏麦3号特异条带;其余13个品系在5AS和6BS的3个多态性标记位点均未检测到苏麦3号的特异条带(表1)。由此可见,k9、k10、k11、k12、k13、k14和k15这7份材料不仅聚合有3BS上的优异等位变异,还聚合有5AS和6BS上的优异等位变异;其余13份材料仅聚合了3BS上的优异等位变异。

A、B、C图分别为分子标记barc133、wmc705、barc101的检测结果。1:979-5;2:苏麦3号;箭头分别示979-5和苏麦3号的特征 谱带。

2.4 新品系的赤霉病抗性

经2018-2019连续两年田间赤霉病单花接种鉴定,20个新品系抗性水平表现稳定可靠,其中高抗品系有7个(k9、k10、k11、k12、k13、k14和k15),中抗新品系有13个(表1,图3)。

箭头指示接种赤霉病菌的小花部位。

表1 赤霉病抗性评价及分子标记分析

2.5 新品系的主要农艺性状

表2 新品系的主要农艺性状

2.6 新品系的主要品质性状

育成的20个新品系四项品质指标(蛋白质含量、湿面筋含量、吸水率和稳定时间)普遍优于苏麦3号(表3)。其中,k15、k32和k40三个品系的蛋白质含量为14.1%~14.6 %、湿面筋含量为30.2%~31.2%、面粉吸水率为58.4%~ 60.8%,面团稳定时间为7.4~8.0 min。在国家中强筋小麦品种标准[28]中要求,蛋白质含量≥13%,湿面筋含量≥28.5%,吸水率≥58%,稳定时间≥7.0 min。可见,新品系k15、k32和k40的四个主要品质指标达到国家中强筋小麦品种 标准。

表3 新品系的籽粒主要品质指标

3 讨 论

近年来,随着全球气候的变化和作物耕作制度的改变,中国小麦赤霉病发病区域呈扩大趋势,已从长江中下游麦区扩展到黄淮麦区[5,29],严重影响中国小麦生产安全。培育抗赤霉病品种已成为中国黄淮麦区小麦育种的主要目标之一[5]。苏麦3号携带有多个抗赤霉病基因/QTLs[7,17],是世界上公认的高抗赤霉病品种,其抗性强且稳定持久。美国、加拿大、澳大利亚等国家利用其Fhb1、Fhb2和Fhb5基因连锁分子标记辅助选择技术[26,30-32],开展抗赤霉病小麦新品种改良。本研究采用系谱选育法,对979-5品系与苏麦3号杂交后代群体,利用分子标记辅助选择技术和赤霉病菌单花接种鉴定技术,结合农艺性状选择,育成携带有Fhb1基因的抗赤霉病优异新品系20份,其中13份新品系仅携带Fhb1基因,其抗性水平表现为中抗;5份新品系(k11、k12、k13、k14和k15)不仅携带有Fhb1,还携带有Fhb2和83.3%Fhb5的优异等位变异,抗性水平为高抗;2个新品系(k9和k10),不仅携带有Fhb1,还携带有Fhb5的83.3%优异等位变异,抗性水平为高抗。由此可见,利用苏麦3号抗性基因分子标记辅助选择时,聚合的抗性基因或优异等位变异数越多,抗性水平越强。Basnet等[33]研究认为,苏麦3号之所以抗性最强和持久,可能与其拥有较多数量的微效QTLs有关。Bai等[34]研究表明,仅仅聚合有Fhb1的材料,并不能完全保护和抵抗赤霉病的危害。这表明,在利用抗赤霉病分子标记辅助选择时,为了提高赤霉病的抗性水平,不仅要进行主效基因Fhb1的标记辅助选择,还需要进行微效基因的标记辅助选择。

本研究之所以能在育成品系的5份材料(k11、k12、k13、k14和k15)中,能同时聚合Fhb1和Fhb2的全部优异等位变异、以及83.3%Fhb5的优异等位变异,与亲本材料979-5在这三个基因位点的遗传基础有关。利用与Fhb1、Fhb2和Fhb5基因紧密连锁的13个SSR标记分析发现,979-5与苏麦3号在这三个基因位点具有较高的遗传相似性:用Fhb1的4个SSR标记(gwm493、barc133、gwm533和barc147)分析发现,其中1个标记(gwm493)在979-5和苏麦3号间扩增带谱相同;用Fhb2的3个标记(gwm133、gwm644、barc101)分析发现,有2个标记(gwm133和gwm644)在979-5和苏麦3号间扩增带谱相同;用Fhb5的6个标记(barc186、barc180、wmc705、gwm293,gwm154和gwm304)分析,其中3个标记(gwm293、barc186和gwm304)在979-5和苏麦3号间扩增带谱相同。这表明,979-5与苏麦3号在Fhb1、Fhb2和Fhb5基因位点遗传相似性分别为25.0%、66.7%和50.0%。979-5源自小麦品种西农979,西农979是苏麦3号的衍生系,携带有苏麦3号的Fhb1基因[35],因此推测,979-5之所以中感赤霉病,可能与其携带苏麦3号抗性相关的优异等位变异有关。由于979-5在Fhb1、Fhb2和Fhb5位点与苏麦3号有较高的遗传相似度,本研究在利用主效基因Fhb1分子标记辅助选择的同时,能有效地聚合微效基因Fhb2和Fhb5位点的部分优异等位变异,其中育成的5个新品系(k11、k12、k13、k14和k15)赤霉病抗性均达高抗水平。本研究在分子标记辅助选择和赤霉病菌接种鉴定的同时,还进行了主要农艺性状和品质性状的选择,育成的新品系不仅对赤霉病抗性得到有效提高,而且丰产性和品质性状也获得提升,因此本研究育成的新品系可作为黄淮麦区小麦新品种改良的优异亲本材料。

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