小麦黑胚病籽粒黑变物质的理化性质分析

李巧云，姜玉梅，徐凯歌，李梦钰，王丝雨，吴青桐

(河南农业大学国家小麦工程技术研究中心/河南省粮食作物生理生态与遗传改良重点实验室，河南郑州 450002)

小麦黑胚病是指小麦籽粒的胚或其周围出现黑或褐色斑点，有时会延伸到腹沟侧，甚至籽粒的冠毛端，严重时，整个籽粒变色皱缩[1-2]。该病害在世界不同小麦种植区广泛发生[1-15]，不仅影响籽粒的外观品质与面粉品质、降低种子出苗与发芽率[4-5]，而且感黑胚病籽粒还存在霉菌毒素污染问题[16-18]。近年来，随着小麦灌浆期间环境条件的变化、品种更替以及施肥条件改善，黑胚病呈现明显加重趋势[6-7]，已成为影响小麦产量及品质的重要因素。

了解黑胚粒的黑变物质来源可为抗黑胚病小麦品种培育与抗黑胚病机理研究提供重要信息。研究表明，小麦黑胚病的发生、发展受致病菌的影响，麦根腐平脐蠕孢(Bipolarissorokiniana)、链格孢(Alternariaalternata)等真菌为小麦黑胚病的主要致病菌[4,8-9]；小麦黑胚病的流行还与环境因素密切相关，尤其是灌浆期的高湿度与较低的温度是该病流行的关键[10-11]。影响因素的多样性使小麦黑胚病出现的机理复杂，对其产生具体原因的报道较少。

一些研究认为，黑胚病症状产生的原因主要是菌丝在籽粒表面积累的结果[9,12-13],如Rees 等[12]认为，黑胚病症状与籽粒受侵染部位菌丝密度有关；而另一些学者则认为，黑胚病症状产生与真菌侵染没有直接关系[1,14-15]，如Williamson[1]将小麦籽粒先后浸泡在酚酸溶液与H2O2溶液中，在体外诱导产生黑胚病症状，推测黑胚症状的形成与酶促褐变有关。

本研究拟从小麦感黑胚病籽粒中的感病部位提取黑变物质，并对其进行理化特征分析，以探究造成黑胚病症状的黑变物质来源。

1 材料与方法

1.1 试验材料及致病菌侵染

试验材料为来源于国家小麦工程技术研究中心遗传育种课题组的高感黑胚病小麦品系宛原白1号，接菌条件下，该品系的发病率在50%以上[2,8]。将供试材料于2017-2018年种植在国家小麦工程技术研究中心的荥阳实验基地，栽培条件同一般育种田。

致病菌株为B.sorokiniana的强致病菌株Ta-BP33，由国家小麦工程技术研究中心小麦抗病遗传育种课题组分离、鉴定[8]。

接菌侵染参照李巧云等[19]的方法，将4 ℃冰箱保存的Ta-BP33置于马铃薯-土豆-琼脂(PDA)培养基上，25 ℃暗培养12 d，制作孢子悬浮液用于接菌侵染；抽穗期挑选发育期一致的穗子，套袋以隔离杂菌，在花后10 d接菌并套袋保湿。成熟后收获，挑选感病籽粒与健康籽粒用于黑变物质的提取。

1.2 黑变物质及致病菌胞外、胞内黑色素的提取

1.2.1 小麦病粒黑变物质提取

小麦籽粒黑变物质的提取与纯化参考Sava等[20]的方法并略有修改。具体提取步骤：(1)将种子用水浸泡12 h，用镊子将黑变部位皮组织(含种皮、表皮、糊粉层及少量胚乳)撕下，干燥后取2.5 g放入研钵内，加液氮研磨后，放入150 mL的三角瓶中，加90 mL去离子水，煮沸15 min后过滤；(2)在滤渣中加入100 mL 7 M的HCl，55 ℃、水解3 h后过滤；(3)将滤渣用蒸馏水冲洗至中性，加50 mL 0.1 M的NaOH,65 ℃提取4 h，重复3次至样品无黑/褐色，于75 ℃水浴3 h，过滤，滤液离心(12 000 r·min-1，30 min)；(4) 上清用2 M的HCl调至pH 2.5，沉淀黑色素，室温静置2 h，离心(10 000 r·min-1， 15 min)，沉淀即为黑变物质粗提物。

纯化步骤：粗提物用7 M的HCl 在100 ℃水解2 h后离心(10 000 r·min-1，10 min)，沉淀分别经水、氯仿、乙酸乙酯、乙醇洗涤后，风机风干沉淀，将其溶解在0.1 M的NaOH中，离心(6 000 r·min-1，10 min)，上清液用2 M的HCl调至pH 2.5，沉淀黑色素，水洗后重复上述过程2次，最后风机风干沉淀，于干燥器内干燥24 h后， -20 ℃保存备用。健康籽粒相同部位提取物的提取方法同病粒黑变物质。

1.2.2B.sorokiniana胞内与胞外黑色素的提取与纯化

胞内黑色素(Bs-in)的提取与纯化:参照Malama等[21]的方法并略作修改，将菌株在PDA培养基上黑暗培养7 d，切5片直径3 mm的菌落接种于PDA 培养基上(pH 6.8)，25 ℃黑暗静置培养10 d。称取1.5 g菌丝，液氮研磨成粉未后转移到50 mL离心管中，加入30 mL 1 M的NaOH充分混匀；沸水浴5 h后，放入-20 ℃冰箱中冷却30 min，双层滤纸过滤，滤液用2 M HCl调pH至2.5，10 000 r·min-1离心15 min，沉淀为黑色素粗提物。

区块链技术在商标领域的证明作用.........................................................................张怀印 凌宗亮 05.76

纯化步骤：将粗提物加5 mL 7 M的HCl，充分混匀，沸水浴2 h后离心(10 000 r·min-1，15 min)，沉淀用1 M的NaOH溶解后，用2 M的HCl调溶液pH至2.5，离心(10 000 r·min-1， 15 min)，重复3次后用蒸馏水洗涤沉淀，沉淀用风机风干，干燥器内干燥24 h，-20 ℃保存。

胞外黑色素(Bs-ex)的提取与纯化：参照曹志艳等[22]的方法并略作修改，在250 mL三角瓶中装入150 mL 土豆-葡萄糖培养基(pH 10.0)，每瓶接入5片直径约3 mm的B.sorokiniana菌落，25 ℃黑暗静置培养10 d，培养液双层滤纸过滤，滤液用2 M的HCl调pH至2.5，10 000 r·min-1离心15 min，沉淀为胞外黑色素粗提物，粗提物的纯化同胞内黑色素。

1.3 黑变物质理化性质分析

1.3.1 黑变物质紫外-可见光谱分析

取提取物2.0 mg，加少量 1 M的NaOH溶解后，以蒸馏水定容至50 mL，配成40 μg·mL-1溶液，进行紫外-可见光连续扫描(200～800 nm)。

1.3.2 黑变物质红外光吸收光谱分析

将提取物制成KBr压片，在500～4 000 cm进行红外光谱扫描。

1.3.3 温度对黑变物质稳定性的影响

取提取物0.25 mg，加少量 1 M的NaOH溶解后，以蒸馏水定容至50 mL，配成5 μg·mL-1溶液。分别置于25 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、90 ℃恒温水浴锅中保温1.0 h，取出后快速冷却至室温，并在各样品最大吸收值的波长下测定吸光度(OD)值。黑变物质的温度稳定性用吸光度的变化率表示，变化率=(OD处理前-OD处理后) / OD处理前×100%。

取提取物0.25 mg，加少量 1 M的NaOH溶解后，以蒸馏水定容至50 mL，配 成5 μg·mL-1溶液，在自然光和避光条件下保存7 d，每天定时测定其吸光度值。黑变物质的光照稳定性用吸光度的变化率表示。

2 结果与分析

2.1 黑变物质的紫外-可见光谱吸收特征

小麦黑胚病感病籽粒黑变物质(BP)与健康籽粒提取物(BPF)、B.sorokiniana的胞内、胞外黑色素(Bs-in与Bs-ex)的紫外-可见光吸收光谱见图1。从图1可以看出，在可见光区，所有样品没有特征吸收峰与极值，吸收值随波长的增大而减小；在紫外光区，所有样品有较强的吸收，吸收值随波长增大而降低。

来源于黑胚病病粒的黑变物质与健康籽粒提取物的吸收峰都在235 nm，且在280～300 nm处有明显的次吸收峰，而B.sorokiniana的胞外、胞内黑色素的吸收峰在210 nm处，二者次级吸收峰出现的波长不一致，胞内黑色素的次吸收峰在270 nm附近，而胞外黑色素的次吸收峰不明显。从紫外-可见光谱吸收特征分析，小麦黑胚病籽粒的黑变物质与致病菌B.sorokiniana的胞内、胞外黑色素有明显不同。

2.2 黑变物质的红外光谱吸收特征

红外光谱可以检测出样品中主要功能基团的存在[20]。本研究中，来源于黑胚病粒的黑变物质与健康籽粒提取物的红外光谱图一致，致病菌B.sorokiniana胞外与胞内黑色素的红外光谱图不完全一致。小麦籽粒提取物与致病菌黑色素红外光谱图不同，如籽粒提取物红外光谱图1 658·cm-1，1 512·cm-1，1 220·cm-1等处的吸收峰在B.sorokiniana黑色素红外光谱图没有(图2)。籽粒提取物的红外光谱图中，3 380·cm-1附近强宽吸收峰为-OH与-NH2峰，2 925·cm-1与2 852·cm-1处的吸收峰是碳氢键(C-H)或脂肪族C=H的伸缩振动形成的，1 709·cm-1的较强吸收峰为C=O峰，1 512·cm-1和1 463·cm-1处的吸收峰为芳香环的吸收峰，1 220·cm-1的吸收峰为有酚的C-O的特征峰，650～860·cm-1处吸收峰较弱，表明苯环被取代，形成了共轭体系[20,22-23]。通过红外分析，小麦黑胚病粒黑变物质有烷基、酚羟基以及羧基等官能团，表明该黑变物质为酚类物质，与王改利等[23]提取的花椒种皮黑色素的红外光谱图相似。B.sorokiniana胞内黑色素在3 380·cm-1、2 925·cm-1、 2 852·cm-1与1 709·cm-1处有较强的吸收峰，与玉米大斑病胞内黑色素红外光谱图相似，可能是属于真菌多聚二羟萘(DHN)类黑色素[22]。

图2 小麦提取物的红外吸收光谱

2.3 黑变物质的温度稳定性

从表1可以看出，各提取物的吸光度均随着温度的升高而降低；不同来源提取物的吸光度变化幅度不尽相同。相比较而言，来源于小麦籽粒(病粒的黑变物质及健康籽粒的提取物)的提取物吸光度变化率整体差异不大；相同温度处理下，病粒黑变物质与健康籽粒提取物间的吸光度变化率没有显著差异，说明二者对温度的稳定性较一致。相同温度下，来源于致病菌B.sorokinian的胞内与胞外黑色素的吸光度变化率均低于来源于小麦籽粒的样品；尤其是胞外黑色素的吸光度变化率在各处理温度下均显著低于其他样品。说明来自B.sorokinian的胞内与胞外黑色素的温度稳定性高于小麦样品，尤其是胞外黑色素。结果表明，源于小麦感病籽粒的提取物与致病菌的黑色素不一样。

WYB-BP与WYB-BPF分别表示感病籽粒与健康籽粒提取物；Bs-in与Bs-ex分别表示致病菌B.sorokiniana的胞内与胞外黑色素提取物。下同。

表1 温度对提取物稳定性的影响Table 1 Effect of temperature on the stability of extract

2.4 提取物的光照稳定性

由表2可以看出，在自然光和黑暗条件下，各样品提取物的吸光度均随放置时间延长而下降，来源不同则下降幅度不同。放置相同时间，各提取物在黑暗条件下的吸光度大多数高于光照条件下。放置7 d后，光照下源于小麦病粒黑变物质的吸光度下降了49.8%，而暗处理的样品吸光度下降了36.0%，源于其他3种样品的提取物吸光度遵循相同规律，说明光照处理对提取物质的影响较大，即其耐光性较差。无论光照还是黑暗条件下，来源于病粒与健康籽粒的样品提取物间的吸光度变化率在7 d后均没有显著差异。

表2 光照对提取物稳定性的影响Table 2 Effect of illumination on the stability of extract

致病菌胞内与胞外黑色素的光稳定性均显著高于小麦籽粒提取物；两种光处理下，病原菌胞外与胞内黑色素的吸光度变化率均无显著差异，与小麦籽粒间有显著差异。

3 讨 论

麦类籽粒黑胚病症状的形成是个有争议的问题。有研究指出，真菌致黑胚病症状产生的主要原因是厚厚的真菌菌丝体附着在小麦籽粒胚部使其变色[24-25]，该结论与Hyde和Galleymore[26]的“小麦籽粒冠毛端比呈现黑胚症状的胚部有更多菌丝体”的研究结果相矛盾；从澳大利亚的黑胚病小麦籽粒上分离最多的真菌是链格孢(A.alternate)，其在整个籽粒表面都能生长，其侵染之处与细胞的变色并不关联[1]。Conner等[14]用Fusariumproliferation侵染生长在加利福尼亚的小麦，产生黑胚症状，然而，在北美及加拿大以外地区进行的研究没发现黑胚籽粒上有F.proliferation；MAK等[15]对小麦黑胚粒与健康籽粒样品进行蛋白组学分析，发现健康籽粒中与胁迫、病害及防御相关的蛋白含量高于病粒，但是病粒中并没有鉴定出真菌与细菌来源的蛋白质。这些研究结果表明，真菌是黑胚病的病因之一，但可能不是黑胚病症状产生的主要原因。

Williamson[1]将小麦健康籽粒依次浸泡在酚类溶液(儿茶酚或酪氨酸)与H2O2溶液中，在体外诱导出黑胚病症状，表明黑胚病症状可能与酶促褐变有关。推测小麦籽粒出现黑胚症状的机理可能为：由于不利的环境因素(如病菌侵染、灌浆期高湿环境引起的穗发芽、或者其它的伤害)存在，小麦籽粒细胞中产生过量的活性氧(ROS)，这些过量的ROS不能及时被清除，引起氧化损伤，使本来分布于不同细胞器中的酚酸物质与过氧化物酶(POD)或多酚氧化酶(PPO)结合，产生醌类物质，醌类发生自聚合或与多种氨基酸或蛋白质反应形成有色终产物[27-28]，病粒中较低含量的抗胁迫相关蛋白意味着其抗胁迫能力较弱[15]，从而产生较多的次级代谢物以提高抗胁迫能力，酚类物质是植物体内重要的次生代谢物，在抵抗生物胁迫和非生物胁迫中起重要的作用[29]。这与本研究中黑变物质红外光谱图反应其可能为酚类物质的结论是一致的，而且，该物质的理化性质与来源于致病菌B.sorokinian的胞外与胞内黑色素不同，这表明引起黑胚症状的黑变物质应该不是真菌菌丝累积或者真菌分泌到籽粒上的胞外黑色素。

来源于黑胚粒的黑变物质与来源于健康籽粒相同部位的提取物具有相同的紫外吸收特征、红外吸收谱，相似的光、热稳定性，表明二者很可能是同一种物质，只是健康籽粒中提取物的得率很低(数据未发表)，这提示小麦黑胚病病粒的黑变物质应该是由小麦籽粒本身合成的，健康籽粒中也可以合成，只是量较少，没有产生肉眼可见的黑或褐色变化。

本研究认为，引起小麦黑胚病症状的黑变物质是小麦籽粒本身合成的，可能是酚类物质，其具体的化学成分有待于进一步的研究。更多相关研究才能更好的揭示小麦黑胚病的黑变机理。