小麦抗病相关基因 TaTGA2.2在小麦-条锈菌互作中的表达分析及功能研究

郭双元，任惠文，张艳琴，冯传欣，冯 浩，王晓杰，康振生，张新梅

(1. 西北农林科技大学生命科学学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100； 2. 西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100)

转录因子在生物和非生物胁迫信号通路中发挥重要作用[1]。碱性亮氨酸拉链蛋白(basic leucine zipper，bZIP)是真核生物转录因子中最大、最保守的类型之一[2]，不仅参与植物的生长发育过程，也参与生物和非生物胁迫的响应，如干旱、高盐、高渗以及病原菌的防御[3-4]。水杨酸(SA)作为一种植物激素，是引起系统获得性抗性(SAR)的免疫信号。病程相关基因非表达子(non-expressor of pathogenesis-related genes 1，NPR1)在拟南芥突变体筛选中首次被发现，是SA的受体，与SA有很高的亲和力[5]。病原菌侵染植物后，植物体内的SA含量会迅速提高，同时以多聚体形式存在的NPR1蛋白会转变为具有生物活性的单体形式，并转运至细胞核内与bZIP类转录因子中的TGA亚家族相互作用，从而调节防御基因的表达，提高植物的抗病能力[6-7]。AtTGA2、AtTGA3和AtTGA5是拟南芥bZIP 转录因子TGA/OBF亚家族中的三个成员，研究发现这三个成员均和NPR1紧密结合[8-10]。烟草TGA2.1/TGA2.2及水稻TGA2.1/TGA2.2/TGA2.3等多个TGA转录因子也均能与拟南芥NPR1相互作用，说明在不同物种间NPR1-TGA间的相互作用是高度保守的[9-10]。

目前，小麦中bZIP转录因子已被广泛研究，如在拟南芥中过表达TabZIP基因可增强对盐、干旱、高温和氧化胁迫的耐受力[2]；过表达TabZIP174基因可提高拟南芥种子萌发率，且参与植物对干旱胁迫的调节[11]。此外，在小麦条锈病菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritici，Pst)的胁迫下，抗病植株中SA受体TabZIP在非亲和组合中被快速诱导表达，表现为正调节作用[7]。而易感病小麦在接种赤霉菌后，bZIP 超级家族蛋白Ta_S12983212表现出明显的负调节作用[12]。以上研究结果均表明，bZIP转录因子在植物响应生物及非生物胁迫方面发挥着重要的调节作用。

bZIP转录因子在小麦响应条锈菌胁迫的调控过程中起着至关重要的作用，但目前具体的机理尚不明确。本研究通过筛选小麦-条锈菌互作的小麦cDNA文库，得到了一个编码bZIP类转录因子的TaTGA2.2基因，并利用实时荧光定量PCR技术分析了条锈菌、激素和非生物胁迫处理后小麦TaTGA2.2基因的表达变化。在此基础上，本研究运用酵母系统验证 TaTGA2.2的转录激活活性，在拟南芥原生质体中进行TaTGA2.2的亚细胞定位，以及利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)初步分析TaTGA2.2基因在小麦与条锈菌互作过程中的功能，以期深入解析小麦与条锈菌互作的分子机理，为合理选育及利用抗病品种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试小麦品种为水源 11，小麦条锈菌为非亲和生理小种CYR23和亲和生理小种CYR31。均由西北农林科技大学植物保护学院提供。

将小麦播种后于光照培养箱中培养(温度 16 ℃，光照强度 6 000 lx，光照时间 14 h)，待幼苗长至一叶一心期，参照康振生等[13]的方法接种条锈菌，分别采集0、12、24、48、72和 120 h 的小麦叶片用液氮冷冻后保存于-80 ℃冰箱备用。

激素处理：对一叶一心期的小麦幼苗分别喷施溶于0.1%(v/v)乙醇的2 mM的水杨酸(SA)，100 mM的茉莉酮酸酯(JA)，100 mM的乙烯(ET)以及100 mM的脱落酸(ABA)，喷施0.1%(v/v)乙醇作为对照[14]，分别采集0、2、6、12、24和48 h样品于-80 ℃备用。

非生物胁迫处理：小麦幼苗根部浸泡在20% PEG 4000以及200 mM NaCl的水溶液中分别进行干旱和高盐处理；用无菌的刀片划伤叶片进行伤处理；小麦幼苗放置在12 h光周期的生长室进行4 ℃低温处理，样品分别在处理0、2、6、12和24 h后采取并存放于-80 ℃备用。

1.2 RNA 的提取与 cDNA 的合成

采用 Biozol 试剂(BioFlux)提取各个取样时间点接种条锈菌的小麦叶片总RNA，cDNA第一链的合成按照Invitrogen公司的M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒操作说明书进行，反转录引物采用oligod(T)18。

1.3 TaTGA2.2基因的克隆

从本实验室构建的水源 11与条锈菌CYR23以及CYR31互作的小麦cDNA文库，从中筛选小麦TaTGA2.2基因的EST序列，并结合实验室现有的数据和NCBI等公共数据库，通过电子克隆得到目标序列。利用软件Primer Premier 5.0在序列两端设计扩增引物TaTGA2.2-F/TaTGA2.2-R(表1)。以1.2中反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系(40 μL)为： Prime STAR Max DNA Polymerase(Takara，Dalian，China)20 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 17 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，36个循环；72 ℃延伸 6 min，16 ℃保存。目标基因胶回收后将其克隆到T-Simple载体上，并进行双向测序。

M：DL2000 标准分子量DNA；P：PCR扩增产物。

1.4 序列分析

将克隆得到的测序序列在NCBI网站上运用BLAST搜索工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对NR(Non-Redundant)数据库进行搜索，进行同源性分析；用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)进行开放阅读框查找；用Premier 5.0将ORF序列翻译成氨基酸序列；使用InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)预测保守结构域或功能域；使用DNAMAN对目的基因氨基酸序列与其他植物的TGA家族转录因子进行序列比对；运用MEGA 5.1软件构建TaTGA2.2与其他bZIP家族成员的系统进化树。

1.5 表达模式分析

根据TaTGA2.2序列设计特异定量引物，选择小麦延伸因子TaEF-1α(GenBank accession number:Q03033)作为内参基因，具体引物序列参照表1。以合成的各个处理样品的cDNA为模板，使用定量仪Bio-Rad CFX96进行实时定量PCR分析。实时荧光定量PCR参照 Guo等[15]的方法。每个处理进行3次生物学重复，根据Ct值求平均值，利用2-△△Ct法[16]计算目标基因的相对表达量。

1.6 亚细胞定位

构建TaTGA2.2与GFP融合表达载体：根据p16318hGFP表达载体的图谱以及TaTGA2.2基因序列选择Hind III、BamH I酶切位点，利用Primer Premier 5.0设计扩增去掉终止密码子的ORF序列的引物，并在上、下游引物上分别引进Hind III、BamH I酶切位点(引物序列参见附表1)。以cDNA为模板，对目的基因进行片段扩增，将正确的扩增片段进行回收和载体构建，然后对构建好的载体进行测序验证。使用Hind III和BamH I对测序正确的载体以及p16318hGFP载体进行双酶切，分别回收目的产物。将目的基因回收产物以及载体回收产物使用T4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌并送测序。

将构建成功的融合载体转化拟南芥原生质体进行瞬时表达分析，观察TaTGA2.2在细胞中的定位情况。原生质体的制备及转化方法参照Ahmed等[17]的方法。

1.7 酵母自激活验证

本实验在前期研究基础上，通过InterProScan保守结构域分析，推测TaTGA2.2的转录激活区域位于N端前46个氨基酸。为了验证此推测，本研究根据TaTGA2.2基因序列设计引物，并引进NdeI和BamH I 限制性酶切位点(引物序列参见表1)，将截去N端1～46个氨基酸的TaTGA2.247-334以及TaTGA2.2全长TaTGA2.21-334构建到酵母表达载体pGBKT7 上(具体方法同1.6)，获得pGBKT7-TaTGA 2.247-334和pGBKT7-TaTGA2.21-334重组质粒。将获得的重组质粒以及阴性对照pGBKT7空载体分别转入酵母菌株AH109中(上海唯地生物技术有限公司)，具体转化方法参照唯地公司产品说明书。将转化产物涂布于SD/-Trp(Takara，Dalian，China)固体培养基上，30 ℃倒置培养。 2 d后，分别挑取上述SD/-Trp平板上的单克隆至SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade/X-α-gal平板上，30 ℃倒置培养3～4 d，观察菌落的生长情况以及颜色的变化。

表1 试验所用引物序列Table 1 Primer sequences used in experiments

1.8 大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)介导的 TaTGA2.2基因沉默

根据TaTGA2.2基因序列分别设计扩增5′非翻译区以及部分编码区和3′非翻译区以及部分编码区两个区域的特异引物(引物序列参见表1)，上下游引物分别引进PacI和NotI酶切位点，用目标片段替换γ-PDS-as阳性对照载体中PDS片段，构建γ-TaTGA2.2-1as和γ-TaTGA2.2-2as两个载体。用MluI酶切BSMV-α、γ载体，用SpeI酶切BSMV-β载体，用BssH II酶切γ-PDS-as、γ-TaTGA2.2-1as和γ-TaTGA2.2-2as载体，并胶回收纯化。以线性化产物为模板使用RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems-T7 试剂盒(Promega,美国)进行体外转录。

取α、β各0.5 μL分别与0.5 μL的γ、γ-PDS-as、γ-gene、γ-TaTGA2.2-1as和γ-TaTGA2.2-2as按 1∶1∶1 混合，再加8.5 μL FES buffer混匀后对三叶期小麦的第二叶进行摩擦接种。具体病毒接种步骤参照Yin等[18]的方法。摩擦FES 缓冲液作为阴性对照，γ-PDS-as作为阳性对照。接种后置于16/8 h光暗周期，25 ℃左右进行培养，定期观察接种γ-PDS-as小麦叶片的漂白以及病毒症状。根据漂白表型出现时间 (12 d左右)，在小麦的第4叶接种条锈菌CYR23或CYR31，接种方法参照康振生等[13]的方法。接种后0、24、48和120 h采取样品用于沉默效率检测及相关基因的表达量分析，在接种后14 d左右观察表型。

2 结果与分析

2.1 TaTGA2.2基因的克隆结果

通过PCR扩增得到一条1 000 bp左右的产物(图1)，利用ORF Finder对克隆测序后的序列进行开放阅读框(ORF)查找，发现其具有1 005 bp 的ORF，编码334个氨基酸。在NCBI网站上进行Blastx搜索分析，结果显示TaTGA2.2蛋白与一粒小麦(Triticummonococcum)TGA蛋白(GeneBank：AGH18703.1)同源性高达99%，同时与二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)TGA2类转录因子(GeneBank：XP_010228695.1)、水稻(Oryzasativa)bZIP转录因子(GeneBank：BAB72061.1)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)TGA转录因子(GeneBank：XP_003627926.1)等也高度同源。

TaTGA2.2、AtTGA2.2、TmTGA、OsbZIP和BdTGA2.2分别来源于普通小麦，山羊草、一粒小麦、水稻和二穗短柄草。

图3 TaTGA2.2 进化树分析

2.2 TaTGA2.2基因的序列分析

TaTGA2.2基因编码334个氨基酸，用Compute pI/MW对编码蛋白分析，发现其分子量为37.25 KDa，等电点为7.87；利用InterProScan对保守结构域进行预测，发现该蛋白具有一个bZIP保守结构域及一个转录因子TGA类似结构域。利用DNAMAN多序列分析显示， TaTGA2.2氨基酸序列与其他物种的TGA氨基酸序列之间具有很高的同源性，且都含有bZIP保守结构域(图2)。系统进化树分析显示，TaTGA2.2与一粒小麦(AGH18703.1)、水稻(BAB72061.1)和玉米(XP_008658211.1)等单子叶植物中TGA处于同一大分支，其中与一粒小麦的亲缘关系最近，二穗短柄草、玉米次之(图3)。为了比较TaTGA2.2与不同类型的TGA家族转录因子之间的进化关系，选择9个拟南芥TGA家族转录因子构建进化树，结果显示TaTGA2.2与AtTGA2/5/6(Clade II)属于同一进化枝(图4)。

图4 TaTGA2.2蛋白与9个拟南芥TGA蛋白的同源性分析

2.3 TaTGA2.2的表达模式

接种条锈菌后TaTGA2.2的表达水平如表2所示。在非亲和体系中TaTGA2.2在24 h显著上调表达，大约是对照表达量的9倍，之后开始下降，在120 h恢复到基础表达水平。亲和体系中，TaTGA2.2的表达趋势与非亲和体系基本一致，但整体表达水平较低。以上结果表明，TaTGA2.2受条锈菌诱导表达，并且可能在小麦抗条锈菌过程中发挥一定作用。

表2 条锈菌诱导下 TaTGA2.2的表达量Table 2 Relative expression of TaTGA2.2 induced by Pst

从表3可知，SA处理2 h和6 h后TaTGA2.2的表达量显著上调，之后表达量降至基础水平；ABA处理6 h后也显著上调；JA和ET对TaTGA2.2表达量的影响不大。表明TaTGA2.2基因可能参与SA和ABA相关信号途径。

表3 TaTGA2.2在激素处理后的相对表达量Table 3 Relative expression of TaTGA2.2 after hormone treatments

从表4可知，TaTGA2.2的表达量在20%PEG 400处理后12 h和24 h显著上调；200 mmol·L-1NaCl处理6 h后也有一定程度的上调，但不显著；划伤以及4 ℃低温处理后其表达量则没有明显变化。表明TaTGA2.2基因可能通过提高其表达量来响应干旱胁迫。

表4 TaTGA2.2在胁迫处理后的相对表达量Table 4 Relative expression of TaTGA2.2 after stress treatments

2.4 TaTGA2.2蛋白的亚细胞定位

TaTGA2.2与GFP的融合表达载体以及空载体对照同时转化拟南芥原生质体，通过Olympus BX-51荧光显微镜观察发现，TaTGA2.2-GFP融合蛋白定位于细胞核中，而对照组GFP分布于整个细胞中(图5)。

2.5 TaTGA2.2的酶母自激活验证结果

为了检测TaTGA2.2的转录激活活性，将融合质粒pGBKT7-TaTGA2.247-334和pGBKT7-TaTGA2.21-334以及阴性对照pGBKT7空载分别转入酵母菌株AH109中。转化后的菌株在SD/-Trp缺陷培养基上都生长良好，表明三个重组质粒都成功转入酵母中，然而只有转入pGBKT7-TaTGA2.21-334的菌株才能在SD/-Trp-His-Ade缺陷培养基上正常生长，并且转入pGBKT7-TaTGA2.21-334的菌株在含有X-α-gal的SD/-Trp-His-Ade的培养基上变成蓝色(图6)，表明TaTGA2.2能够激活His等报告基因的表达。以上结果表明，TaTGA2.2具有转录激活活性，并且转录激活区域位于N端前46个氨基酸序列中。

A：转化菌株在SD/-Trp培养基上的生长情况；B：转化菌株在SD/-Trp-His-Ade培养基上的生长情况；C：转化菌株在含有X-α-gal的SD/-Trp-His-Ade培养基上的生长情况；D：指示相应检测载体。

2.6 TaTGA2.2基因沉默后的表型及分析

为了进一步分析TaTGA2.2的功能，借助条锈菌 CYR23 与小麦水源 11的非亲和互作体系及CYR31 与小麦水源 11的亲和互作体系，进行了病毒介导的VIGS试验。在摩擦接种空病毒BMSV:γ以及重组病毒BMSV:TaTGA2.2-1as和BMSV:TaTGA2.2-2as 12 d后，叶片均出现轻度退绿、花斑症状，而接种BMSV:PDS-as的叶片出现明显的漂白现象(图7-A)。对沉默的植株、FES处理以及接空病毒的对照组植株分别接种条锈菌CYR23和CYR31两个生理小种，14 d后进行表型观察(图7-B)，发现在亲和组合中，对照组和试验组均大量产孢，产孢数量无明显差异；在非亲和组合中，对照组和实验组均出现典型的过敏性坏死，表型上无明显差异。

A：接种空病毒BMSV:γ、重组病毒BMSV: TaTGA2.2-1as和BMSV: TaTGA2.2-2as以及BMSV:PDS 9 d后的病毒症状；B：沉默叶片接种条锈菌CRY23和CYR31的表型。

为确定目的基因的沉默效率，在接种0、24、48和120 h后取样，利用qRT-PCR技术进行表达量分析，结果显示TaTGA2.2的表达受到显著抑制，沉默效率在60%～80%之间(图8)。同时检测可能与TaTGA2.2发挥功能相关基因 (NPR1、PR1、PR2以及PR5)的表达水平，发现TaTGA2.2沉默后，与对照组相比NPR1在120 h显著上调，而PR1、PR2以及PR5的表达水平在沉默前后均无明显变化(图9)。

*表示与对照组相比差异显著。

*表示与对照组相比差异显著。

3 讨 论

bZIP类转录因子是许多植物发育和生理过程的主要调节因子，包括胚的形态发育、种子的形成、非生物以及生物胁迫响应等[19]。bZIP基因表达模式的调整和活性的改变通常会导致各种信号途径以及不同生理过程调控网络的激活[20]。由TGA组成的一类bZIP转录因子作为SA信号的调控因子参与植物对生物胁迫的响应应答[21]。

本研究克隆得到一个小麦基因TaTGA2.2，编码bZIP类转录因子。通过同源性比对以及结构域预测，发现该序列包含典型的bZIP保守结构域和TGA转录因子类似结构域，据此推测TaTGA2.2为小麦TGA家族bZIP转录因子。典型的转录因子具有核定位信号(NLS)及转录调控区[22]，利用拟南芥原生质体亚细胞定位试验证明TaTGA2.2定位于细胞核，同时利用酵母实验表明 TaTGA2.2的N端具有转录激活活性。以上结果表明TaTGA2.2是一个小麦TGA家族转录因子，在植物细胞核中作为转录激活因子发挥功能。

植物通过调整bZIP基因的表达模式激活不同的信号通路，从而调节不同的生理过程[20]。本研究对TaTGA2.2基因在小麦与条锈菌互作中的表达模式进行了分析，发现TaTGA2.2在非亲和互作中表达量明显上调，与TabZIP1在小麦与条锈菌非亲和互作中表达类似[23]。因此推测TaTGA2.2可能参与调控小麦对条锈菌的防御反应。另外，植物激素介导的系统信号能影响植物的抗病性水平，SA信号调控植物对活体营养病原菌以及半活体营养病原菌的抗性，而JA和ET的组合则激活植物对腐生营养病原菌的抗性[24]，通常这两个信号途径起相反的作用，提高对活体营养病原菌的抗性会伴随着对腐生营养病原菌的感病性的增加，反之亦然[25]。我们发现TaTGA2.2的表达量在外源激素SA处理的早期显著上调，而受JA和ET影响不大，表明TaTGA2.2可能与SA信号途径介导的抗性相关。有研究发现TGA家族成员能与一个锚蛋白NPR1互作[21]，SA诱导下NPR1首先解聚形成单体，然后通过核孔进入到核中[26]，最后作为一个辅助激活因子结合TGA2形成PR1启动子上的增强[27-28]。据此推断，TaTGA2.2可能通过与NPR1互作参与SA信号途径介导的小麦对条锈菌的防御反应。此外，一些bZIP蛋白还参与植物对环境因素胁迫的响应，包括盐和干旱胁迫[19]。例如，ABF/AREB蛋白通过ABA依赖的信号转导途径响应干旱和盐胁迫[29-30]。拟南芥中过表达ABF3和ABF4导致ABA/胁迫调控基因的表达水平改变，植株蒸腾作用减少及干旱耐受性增强[31]。试验表明TaTGA2.2也受外源激素ABA以及干旱和高盐胁迫诱导上调表达，推测TaTGA2.2可能还参与ABA信号介导的植物对干旱和高盐胁迫的响应过程。

本研究利用VIGS技术对TaTGA2.2进行沉默，发现接种不同条锈菌小种以后表型没有出现明显差异。研究发现受SA类似物INA诱导的PR-1基因的表达以及病原体的抗性在拟南芥tga6-1tga2-1tga5-1三重突变体中被抑制，然而在tga6-12和tga2-1tga5-1突变体中则不被抑制。此外还发现单个TGA2或者TGA5就能补足由于TGA三重突变体导致的SAR表型的丧失，表明TGA2、TGA5和TGA6对诱导SAR是必要的，但功能上却又是冗余的[32]。介于TaTGA2.2与拟南芥TGA2/5/6的高度同源性，推测小麦TGA家族成员也存在功能冗余，TaTGA2.2沉默后其他TGA家族成员能够弥补由于TaTGA2.2沉默导致的功能缺陷。TaTGA2.2沉默后PR基因的表达水平与对照相比没有明显差异，进一步证实了以上推测。鉴于TGA家族成员能通过与NPR1互作在SA信号途径中发挥重要作用，对沉默TaTGA2.2后NPR1的表达水平进行了检测，发现其在120 h显著上调，推测可能由于在非亲和体系中，条锈菌的侵染诱导SA含量增加，NPR1的表达量随之上调，而TaTGA2.2的沉默影响了NPR1与其之间互作层面的平衡关系，导致NPR1蛋白的积累，具体机理还有待进一步研究。