利用人工合成小麦RIL群体进行小麦穗长和穗宽性状的QTL分析

水志杰,安沛沛,刘天相,吴洪启,刘 乐,史 雪,王中华

(西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100)

麦穗是小麦籽粒的唯一载体，小麦穗长与小穗数、穗粒数及千粒重等产量性状紧密相关。有小麦育种家指出，要将穗长作为小麦品种培育过程中的重要衡量指标进行研究和利用，在考种环节中要将小麦穗长作为一个重要的农艺性状进行测量和分析[1-2]。曹 东等[3]以两个人工合成小麦改良品种构建的F2群体为试验材料，在2D、3B和5B染色体上定位到4个与穗长相关的QTL；侯立江[4]以普通小麦和超小穗小麦为亲本构建的F2群体为试验材料，检测到8个加性QTL，并认为其中位于3A染色体上的QTL很可能控制穗长性状。前人的研究内容多集中于小麦穗长性状，却对控制穗长的基因少有报道。宋 楠[5]对冰草不同性状进行研究，指出穗宽与小穗数紧密相关，但关于小麦穗宽性状的研究鲜有报道。因此，通过构建超高密度遗传图对小麦穗长、穗宽性状进行研究仍有必要。

随着育种进程的不断推进，优势基因被重复利用，使得普通小麦的遗传多样性愈发狭窄[6]。山羊草作为普通小麦的祖先种之一，具有抗病、抗虫和抗旱等特征，而人工合成小麦则是由四倍体硬粒小麦(Triticumdicoccoides，AABB)与山羊草(Aegilopstauschii，DD)经人工杂交创制而成。人工合成小麦与普通六倍体小麦(TriticumaestivumL.,AABBDD)杂交，可以将人工合成小麦中的优异基因转移到普通小麦中[7]，是利用野生基因资源的重要桥梁[8]。挖掘利用人工合成小麦的优异基因，对拓宽现代小麦育种基因资源，丰富小麦遗传多样性具有重要意义。自20世纪90年代，国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)利用山羊草和硬粒小麦创制人工合成小麦以来，使用人工合成小麦对普通小麦进行遗传改良，已成为许多国家小麦育种工作的重要内容[9]。张 颙等[10-11]在研究中指出，利用来自CIMMYT的人工合成小麦与本地普通小麦经杂交选育的川麦42与川麦38具有高产、高抗的优良特性，对普通小麦的品种改良和培育极具指导意义。

本试验以人工合成小麦和普通小麦为亲本构建了F7∶8RIL群体，基于小麦55K SNP芯片对F7RIL群体构建遗传图谱，对穗长和穗宽性状进行QTL定位及遗传分析，为挖掘新的基因位点以及利用人工合成小麦对栽培种小麦进行遗传改良提供参考，同时也为进一步开展对目标性状的相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料包括人工合成小麦KU98、普通栽培小麦西农389以及由西农389 × KU98创制的包含152个F7∶8重组自交系(Recombinant inbred lines,RILs)群体，由西北农林科技大学胡银岗教授提供。其中，KU98的穗子长而窄，西农389的穗子短而宽(图1)，KU98由来自伊朗的粗山羊草(代号KU-2098)与四倍体硬粒栽培种小麦品种Langdon杂交获得。

图1 西农389和KU98的穗部性状

1.2 方 法

1.2.1 田间种植及性状调查

2017年(F7)和2018年(F8)分别将RIL群体及其亲本种植在陕西杨凌西北农林科技大学北校区试验田。采用随机区组设计，设置三次重复，每株系种植1行，行长 1 m，行距 25 cm，株距 10 cm。于小麦成熟后，分别从每个株系中选取5株长势一致的小麦，对其主茎的穗长和穗宽进行测量，穗长的测量值为穗柄至穗尖的长度，穗宽的测量值为最宽小穗的宽度，均以直尺进行测量，穗长和穗宽的测量值均不包含芒长。

1.2.2 DNA样品制备

取F7∶8RIL群体及2个亲本苗期叶片，采用CTAB法[12]提取DNA，使用浓度为1%的琼脂糖凝胶检测DNA质量，利用微量核酸测定仪(NanoDrop One，Thermo ScientificTM)检测DNA 浓度。

1.2.3 芯片数据分析

小麦55K SNP芯片分型分析及样品质检工作由北京博奥晶典生物技术有限公司完成，小麦55K SNP芯片包含53 063个SNP标记，覆盖小麦的21对染色体。采用Genomestudio v1.0 软件进行多态性分析获得基因型数据后，在两个亲本间进行多态性标记筛选，根据QTL IciMapping V4.1作图软件(www.isbreeding.net)对基因型数据格式的要求，在RIL群体中分别将与母本相同的标记记为0，与父本相同的标记记为2，将分型失败的标记记为-1，杂合基因型记为1。

1.2.4 表型数据分析

用Excel 2016对F7∶8RIL群体穗长和穗宽的表型值进行汇总和均一化处理，利用IBM SPSS Statistics 18数据分析软件对穗长和穗宽的表型值进行方差分析及正态分布检验。

1.2.5 遗传连锁图谱构建及QTL分析

基于小麦55K SNP芯片分型结果与表型分析结果，利用QTL IciMapping 4.1软件对RIL群体各株系的基因型进行遗传连锁分析并作图，利用Kosambi作图函数将重组率转换为遗传距离(cM)[13]。在此基础上，使用软件的BIN程序以20%为缺失率(missing rate)的阈值去除缺失率较高的标记及冗余标记，使用MAP功能对SNP标记进行分析并绘制遗传连锁图，默认扫描步长为1 cM，显著检验水平为0.05，排列检验次数为1 000，利用SDL功能对参与作图的标记进行卡方检验，检验RIL作图群体是否符合理论分离比率(1∶1)[14]，在BIP功能程序中默认LOD为2.5，选择完备区间作图法(ICIM-ADD)对目标性状进行QTL定位和加性遗传效应分析。最后使用Map Chart 2.2绘制遗传连锁图及中国春小麦参考基因组物理图谱(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)。

QTL命名方式参考Mccouch等[15]的方法，即QTL + 性状英文名称+ 染色体英文名称 + QTL数目，其中所有名称均使用英文缩写表示，如qSL-1A.1表示位于1A染色体上第1个与穗长相关的QTL。如果QTL的表型变异解释率(PVE%)大于10%，则认为该QTL为主效QTL。

2 结果与分析

2.1 亲本及F7∶8 RIL群体性状变异分析

由表1可知，2018和2019年，父本KU98的穗长分别为13.78 cm和14.84 cm，穗宽分别为0.70 cm和0.92 cm，母本西农389的穗长分别为8.92 cm和9.08 cm，穗宽分别为1.60 cm和 1.64 cm。t检验表明穗长和穗宽性状在父、母本间具有极显著差异。对2018和2019年RIL群体穗长和穗宽性状的表型值分别进行单样本 Kolmogorov-Smirnov检验，P值(K-S检验值)均大于0.05，说明目标性状在F7∶8RIL群体中呈连续分布，且符合正态分布(表1、图2)。因此，可以利用此RIL群体对目标性状进行QTL定位 分析。

表1 亲本及RIL群体表型变异分析Table 1 Phenotypic variation in parents and RIL population

2.2 高密度遗传连锁图构建及分析

本研究所使用的小麦55K SNP芯片由小麦660K SNP芯片优化而来。基于芯片分型的结果，对亲本(西农389×KU98)进行多态性标记筛选，共得到23 785个纯合的多态性标记，利用QTL IciMapping软件对F7RIL群体全部株系的标记数据进行遗传图谱的构建，使用软件的BIN功能去除冗余标记后，共获得4 831个参与遗传图谱构建的标记。

利用本试验群体所构建的遗传图谱包含26个连锁群，覆盖小麦21条染色体，全基因组总遗传距离为7 960.26 cM，平均标记密度为1.65 cM。2D染色体存在最大的连锁群，由327个SNP标记构成，长度为609.18 cM；7B染色体存在一个最小连锁群，由6个SNP标记组成，标记区间长度为13.2 cM，平均标记密度为2.20 cM。A、B、D三个亚基因组的标记数目分别为1 647、 1 707和1 477个(表2)。构建遗传图谱的群体基因型标记经过软件SDL程序的卡方检验(2)后，其亲本基因型在群体中的分离比分别为 1∶1.11，接近理论分离比1∶1，符合遗传作图的要求。

表2 高密度遗传图谱信息Table 2 Summary of high-density linkage map

A和C分别表示F7 RIL群体穗长和穗宽性状的表型频率分布；B和D分别表示F8 RIL群体穗长和穗宽性状的表型频率分布。

2.3 小麦穗长及穗宽性状的QTL定位及分析

基于已构建的遗传连锁图谱和两年的表型数据对RIL群体的穗长和穗宽性状进行加性QTL分析，结果见表3和图3。

2018年检测到3个与穗长性状相关的QTL，分别位于2D、5A和7B染色体上，其加性效应均为正值。2019年检测到7个与穗长相关的QTL位点，分别位于1A、2D、3A、5A和7B染色体，除qSL-1A.1和qSL-7B.3外，其余位点加性效应均为正值，其中，3个主效QTL的贡献率大于10%，分别为qSL-1A.2、qSL-5A.2和qSL-7B.2，对应的标记区间分别为AX-110944881～AX-111592607、AX-108792246-AX～111048027和AX-111650139～AX-110087763，LOD值分别为16.35、16.68和18.00。

2018年检测到6个与穗宽性状相关的QTL，分别位于2D、4D、5A、6A和7D染色体上，其中，qSW-2D.1和qSW-5A.1均为主效QTL，分别位于2D和5A染色体上，标记区间分别为AX-89728114～AX-109842248、AX-108792246～AX-111048027，LOD值分别为9.54和13.94，贡献率分别为10.16%和16.38%。2019年检测到4个与穗宽相关的QTL，分别位于2D、4D、5A和7D染色体上，位于5A染色体上的qSW-5A.1为主效QTL，标记区间为AX-108792246～ AX-111048027，贡献率为26.25%，LOD值为14.74，检测到的所有与穗宽性状相关的QTL位点的加性效应均为负值。

为了对定位结果进行综合分析及方便与前人研究结果进行比对检验，将本研究中穗长和穗宽性状的定位结果与普通小麦中国春的物理图谱进行比对。由于连锁群及其标记过多，故仅选取1A、2D、4D、5A和7B连锁群10%～20%的标记在Map Chart软件中进行绘图(表3、图3)。比对结果发现，三个与穗长相关的主效QTL(qSL-1A.2、qSL-5A.2、qSL-7B.2)分别位于1A染色体的51 966.53～54 498.55 kb区间、5A染色体的646 360.11～651 554.41 kb区间和7B染色体的12 587.55～12 966.27 kb区间。两个与穗宽相关的主效QTL(qSW-2D.1、qSW-5A.1)分别位于2D染色体的23 102.53～26 344.37 kb区间和5A染色体的646 360.11～651 554.41 kb区间。此外，比对结果还发现，位于2D染色体的4个QTL分布较为集中，其中qSL-2D.1两年定位区间均位于2D染色体的30 493.66～ 31 582.96 kb区间，标记区间均为AX-111939856～AX-111497351，说明qSL-2D.1是一个稳定的微效QTL；qSW-2D.1和qSW-2D.2在连锁图谱和物理图谱的分布较近，认为在2D染色体的15 433.40～21 554.25 kb区间存在与穗宽相关的QTL。位于4D和5A染色体的qSW-4D.1(位于4D染色体的439 696.45～439 870.27 kb区间)和qSW-5A.1两年间的定位结果一致，说明qSW-4D.1和qSW-5A.1分别是稳定的微效QTL和主效QTL。而位于7B染色体的qSL-7B.2的物理区间与qSL-7B.1(位于7B染色体的11 725.56～13 704.17 kb)完全重叠，且qSL-7B.2与qSL-7B.1标记区间的遗传距离较近(4.12 cM)，认为两者为同一位点。

表3 2018和2019年穗长和穗宽性状的加性QTL分析Table 3 Additive QTL analysis of spike length and spike width in 2018 and 2019

3 讨 论

作图群体亲本的选配是构建遗传连锁图谱的基础，亲本间的遗传差异与定位结果的准确性紧密相关[16]。本研究中RIL群体的母本西农389由多个亲本经复交和有限回交选育而成，遗传基础丰富，父本KU98由硬粒小麦和山羊草经人工杂交创制而成，两者的遗传背景差异明显，为进行有效地QTL定位奠定良好基础，同时RIL群体可以作为永久作图群体继续进行多年多点的QTL检测。

遗传图谱是QTL定位和遗传分析的重要工具。本研究使用商业化的小麦55K SNP芯片对F7∶8RIL作图群体进行扫描，构建了包含4 831个多态性SNP标记的高密度遗传连锁图谱，父母本基因型在作图群体中的分离比为1∶1.11，接近理论遗传分离比，说明群体在人工选择构建的过程中未出现偏分离，A、B、D三个亚基因组的标记分别为1 647、1 707和1 477个。崔德周等[17]基于90K SNP芯片对莱州953 ×山农辐63组合构建的F2群体进行遗传图谱绘制，其标记数目在基因组的分布为B>A>D，与本研究标记分布趋势一致。而崔德周等[17]的研究结果指出，标记数目在三个基因组的分布并不平衡，但在本研究中三个亚基因组的标记数目接近，造成这一差异的原因是本研究使用的小麦55K SNP芯片与90K SNP芯片标记分布不同。55K和90K SNP芯片是我国目前主流的小麦商用芯片，90K SNP主要面向欧美小麦品种进行设计，且其硬粒小麦和山羊草等近缘种的SNP标记只有十分之一左右，标记在基因组的分布并不平衡。而55K芯片标记SNP由660K芯片经优化筛选而来，其标记A、B、D基因组的分布更为均匀，作为高密度的经济优惠型芯片，更加适合对中国小麦进行多样本检测。

穗长性状与穗粒数关系密切[18]，间接影响小麦产量。前人对小麦穗长性状的研究报道指出，小麦穗长性状相关QTL在1AS、1BL、2A、2BL、2DL、3A、3B、4B、5B和7A等多条染色体均存有分布[19-22]。武炳瑾等[23]利用周 8425B与小偃81杂交构建的F8RIL群体和90K SNP芯片在三个环境条件中共检测到18个与穗长相关的QTL位点，分布于1A、1D、2B、2D、3A、3B、4A、5B、6A、6B、7A、7B 和 7D 染色体上，包含9个主效QTL，其中qSL.NAFU-6A.2和qSL.NAFU-7A是位于6A和7A染色体的环境稳定性主效QTL。李 聪等[23]利用55K SNP芯片和普通小麦构建的F6 RIL群体经过多年多点试验，检测到27个与穗长相关的QTL，分布于1A、1D、2B、2D、3A、4A、4B、5A、5B、6A和7D染色体，其中共检测到4个与穗长相关的稳定主效QTL，分别位于2D和4B染色体。其中，qSL-SAU-2D.1的标记区间为AX-111096297～AX-109422526，其物理位置在2D染色体上32.97 Mb处，与本研究中qSL-2D.1的物理区间(2D染色体的30 493.66～ 31 582.96 kb)比较接近，推测这两个位点之间存在与穗长性状相关的QTL。本研究连续两年在2D、5A和7B染色体检测到穗长相关的QTL，其中qSL-2D.1两年检测到的标记区间一致，qSL-7B.1与qSL-7B.2的标记区紧密相邻，并且两者的物理区间重叠，所以认为qSL-7B.1与qSL-7B.2为同一位点。本研究中与穗长性状相关的稳定QTLqSL-2D.1与李 聪等[24]的定位结果相同，而与武炳瑾等[23]的研究结果存在一定差异，推测造成这种差异的原因有两点，一是本研究中作为父本的人工合成小麦遗传背景与普通小麦不同，二是本研究还缺少对目标性状多点环境下的检测。武炳瑾等[23]对检测到的与穗长性状相关的QTL进行加性效应分析，认为穗长性状的有利变异来源于父本(小偃81)，该观点与本研究的分析结果一致。

F7群体QTL定位结果用蓝色表示；F8群体QTL定位结果用红色表示。

穗宽作为穗部性状之一，宋 楠[5]在对小麦近缘种之一的冰草进行了多个性状的研究分析，指出穗宽与小穗数具有正相关关系，说明穗宽也会对产量产生影响。而目前对小麦穗宽性状的QTL定位研究鲜有报道，本研究经过连续两年的表型调查统计，发现两年间均检测到与穗宽性状相关的qSW-4D.1与qSW-5A.1，表明它们是可靠的QTL位点，且qSW-5A.1两年的贡献率分别高达16.38%和26.25%，是一个稳定的主效QTL，此外，qSW-5A.1与qSL-5A.2标记区间相同，推测该位点具有一因多效的遗传效应或连锁遗传关系，该研究结果为穗宽性状的进一步研究奠定了基础。