白细胞介素-13对人支气管上皮细胞SPDEF表达的影响及SPDEF在哮喘气道黏液高分泌中的作用

程丹 陈恒睿 王梦玫 李晓尘 王涛 胡克

黏液过度分泌是气道慢性炎症性疾病(包括支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张及肺囊性纤维化等)的主要临床特征之一[1]。气道黏液分泌过多与呼吸道感染频率增加、感染持续时间延长及肺功能下降有关[2]。黏液栓堵塞气道也是引起致死性哮喘的主要原因[3]。气道黏液由黏膜上皮和黏膜下腺体中的黏液分泌细胞产生，其主要来源是杯状细胞。高分子粘蛋白MUC5AC和MUC5B是气道黏液的主要组成成分，杯状细胞的过度增生和MUC5AC表达上调是哮喘气道黏液过度分泌的主要特征[4]。目前已有研究结果证实，辅助性T细胞2(Th2)细胞因子白细胞介素(IL)-13介导杯状细胞增生，且在过敏原引起的气道炎症和气道黏液过度分泌中发挥重要作用[5]。含有SAM尖端结构域的ETS转录因子(SPDEF)是粘蛋白表达的关键转录调控因子，其参与Th2炎症反应介导的杯状细胞分化，在调节黏液的产生过程中起关键作用[6]。本研究通过观察IL-13对人支气管上皮细胞SPDEF表达的影响，旨在探讨SPDEF在哮喘气道黏液过度分泌中的作用。

材料与方法

1.材料：人原代支气管上皮(NHBE)细胞购于美国标准生物品收藏中心(ATCC)，BEGM培养基(瑞士Lonza公司)、胎牛血清(FBS)、胰酶(美国Gibco公司)、重组的人IL-13细胞因子(美国Peprotech公司)、转染试剂Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)、SPDEF siRNA(中国RiboBio公司)、Opti-MEM培养基、MUC5AC抗体(美国Thermo Fisher公司)、MUC5B抗体(美国Santa Cruz公司)、荧光二抗488、荧光二抗568、SPDEF、MUC5AC及MUC5B引物、逆转录试剂盒、SYBR实时荧光定量试剂(日本TaKaRa公司)、RNA/DNA/蛋白提取纯化试剂盒(加拿大NORGEN公司)。

2.方法

(1)细胞培养和模型制作：将NHBE细胞均匀地种植于6孔板内，分为对照组、IL-13组及IL-13+SPDEF siRNA组，每组3孔。每孔加入2 ml含10% FBS的BEGM培养基，待细胞融合约90%左右，参照操作说明书使用转染试剂Lipofectamine 2000将SPDEF siRNA转染至IL-13+SPDEF siRNA组NHBE细胞内，对照组和IL-13组均加入同体积的转染试剂Lipofectamine 2000+阴性对照siRNA混合物，3组均更换为无血清的Opti-MEM培养基。24 h后，去除转染试剂和培养基，并将细胞转移至Transwell培养小室内，上层小室加150 μl培养基，下层小室加600 μl培养基，置于37 ℃恒温培养箱内。待细胞完全融合(约2～3天)时，即开始细胞的气液界面培养(去除Transwell培养小室的上层培养基，规律更换小室下层培养基)。从培养的第21天开始，在IL-13组和IL-13+SPDEF siRNA组的下层培养基中加入人IL-13(10 ng/ml)并持续干预细胞7天，至培养第28天时，将第1孔的Transwell细胞进行胰酶消化，收集细胞，参照RNA/DNA/蛋白提取纯化试剂盒的说明书进行操作，提取细胞中总RNA，置于-80 ℃冰箱保存备用。第2孔的Transwell细胞进行流式细胞术检测，第3孔的Transwell细胞进行固定及免疫荧光染色。

(2)实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测SPDEF、MUC5AC及MUC5B mRNA的表达：将提取的3组细胞总RNA分别进行浓度测定，然后按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录，合成模板cDNA。按照SYBR PCR试剂盒说明书进行real-time PCR，反应条件为：反应体系共10 μl，扩增条件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，共40个循环。

(3)流式细胞术检测MUC5AC阳性细胞数量和免疫荧光强度：细胞消化后计数，用新鲜配制的4%多聚甲醛固定液(PFA)固定，冰上放置10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后将细胞重悬于通透液中30 min，再孵育MUC5AC抗体约1 h，并设置同型对照，上机检测。

(4)免疫荧光染色检测粘蛋白的表达水平：采用Carnoy’s固定液将Transwell上层小室固定30 min，再采用PBS-Triton X-100透化20 min，5%山羊血清封闭30 min，加一抗于4 ℃孵育过夜，第2天避光孵育荧光二抗及DAPI染核，再用1% PFA固定，防荧光淬灭剂封片，在共聚焦显微镜下进行观察拍照。

结 果

1.3组NHBE细胞SPDEF、MUC5AC及MUC5B mRNA表达水平的比较：IL-13组NHBE细胞SPDEF和MUC5AC mRNA的表达水平均明显高于对照组(P<0.001)，而MUC5B mRNA的表达水平明显低于对照组(P<0.05)；IL-13+SPDEF siRNA组NHBE细胞SPDEF和MUC5AC mRNA的表达水平均明显低于IL-13组(P<0.001)，而两组MUC5B mRNA的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；IL-13+SPDEF siRNA组MUC5B mRNA的表达水平明显低于对照组(P<0.05)，而两组SPDEF、MUC5AC mRNA的表达水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组NHBE细胞SPDEF、MUC5AC及MUC5B mRNA表达水平的比较

2.3组NHBE细胞中MUC5AC阳性细胞数量和免疫荧光强度比较：IL-13组MUC5AC阳性细胞数量和免疫荧光强度均明显高于对照组(P<0.001)；IL-13+SPDEF siRNA组MUC5AC阳性细胞数量和免疫荧光强度均明显低于IL-13组(P<0.001)；而对照组和IL-13+SPDEF siRNA组MUC5AC阳性细胞数量、免疫荧光强度比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组NHBE细胞中MUC5AC阳性细胞数量和免疫荧光强度比较

3.3组NHBE细胞粘蛋白MUC5AC和MUC5B的表达水平比较:IL-13组NHBE细胞MUC5AC的表达水平明显高于对照组，而MUC5B的表达水平低于对照组。IL-13+SPDEF siRNA组NHBE细胞MUC5AC的表达水平明显低于IL-13组，而MUC5B的表达水平较IL-13组无明显改变。见图1。

讨 论

支气管哮喘是常见的慢性炎症性呼吸系统疾病，其主要特征是气道嗜酸性粒细胞炎症、气道高反应性及黏液过度分泌[7]。通过纤毛在气道上皮细胞的移动，将病原体捕获在气道产生的黏液中，并通过纤毛的清除功能排出黏液。当黏液过度分泌时，纤毛的清除能力下降，导致黏液栓形成堵塞气道，严重时可诱发致死性哮喘[8]。气道黏液的主要成分是上皮杯状细胞分泌的粘蛋白，杯状细胞过度增生和粘蛋白MUC5AC异常高表达是导致气道黏液过度分泌的主要机制之一[9]。研究发现，哮喘患者气道上皮细胞中杯状细胞的数量大约是健康人群的3倍[10]。

IL-13是由Th2细胞分泌的多效性细胞因子，研究报道IL-13可诱导气道上皮杯状细胞过度增生和黏液过度分泌，引起气道阻塞和肺功能障碍，使用IL-13抑制剂或敲除编码IL-13的基因后，气道杯状细胞数量和粘蛋白MUC5AC表达水平均明显降低[11]。SPDEF是前列腺中表达相对丰富的ETS家族转录因子之一，最初被称为前列腺特异性ETS，主要表达于气管、支气管和腺体的上皮细胞中。尘螨暴露和IL-13的存在可诱导SPDEF表达上调和杯状细胞增生，SPDEF在Th2细胞因子和过敏原引起的黏液细胞增生和黏液分泌增多过程中发挥重要作用[12-13]。

在本研究中，我们发现使用IL-13干预NHBE细胞，可诱导SPDEF表达上调，并明显增加MUC5AC的表达，但将SPDEF siRNA转染至NHBE细胞后，即使有IL-13的干预，上述作用仍被抑制，SPDEF沉默导致MUC5AC mRNA和蛋白的表达水平进一步下调，表明成功抑制了粘蛋白的合成，进而导致气道上皮杯状细胞数量减少、黏液MUC5AC分泌量下降，提示SPDEF可能是IL-13诱导MUC5AC表达调控的关键因子，SPDEF的下调降低了IL-13诱导的MUC5AC表达。众所周知，siRNA发挥作用的原理是靶向并降解mRNA。由于mRNA的不断产生，新生的dsRNA需要反复合成与降解，从而持续形成新的siRNA，因此，siRNA的沉默作用一般是短暂的，无法有效评估脱靶效应，这也是本研究的不足之处，在未来临床研究及应用之前，使用CRISPR/Cas9系统结合特异性和靶细胞特异性进一步评估脱靶效应十分必要。

综上所述，采用IL-13刺激NHBE细胞构建哮喘模型，转录因子SPDEF和粘蛋白MUC5AC均明显上调，而抑制SPDEF表达后，NHBE细胞中杯状细胞的数量和黏液分泌均明显减少，粘蛋白MUC5AC的表达明显下调，而对MUC5B的表达无明显影响，提示SPDEF是调控IL-13诱导MUC5AC过表达的关键转录因子，可能参与了哮喘气道黏液过度分泌的发病机制，IL-13通过诱导SPDEF上调，促进气道粘蛋白MUC5AC的高表达，引起哮喘气道黏液高分泌。