气相色谱法检测饲料添加剂中的柠檬醛、D- 柠檬烯和甲基庚烯酮

◆作者：林茂发

随着畜禽和水产养殖业的日益工厂化和工业化，对配合饲料的质量要求不断提高，优质的配合饲料是养殖业取得成功的基础，也是养殖企业为社会提供绿色安全肉类产品的基本保证。因此，生产出安全、高效、环保无公害的配合饲料是饲料生产企业的目标，饲料添加剂作为配合饲料的重要组成之一，对配合饲料的质量有重要的影响，在营养成分相当的条件下，合理使用添加剂可以改善配合饲料的适口性、增强诱食性、增强养殖动物的免疫力，减少抗生素等药物的使用，实现养防结合，提高配合饲料的转化率。

饲料添加剂开发技术经过多年的发展，尤其是中医中药学理论在饲料添加剂生产实践的应用，大量以中草药或者植物提取物为主要活性成分的绿色、高效的功能型饲料添加剂被开发出来并投入饲料加工及养殖中。养殖实践证明，采用中药或植物提取物作为饲料添加剂不会对动物体产生毒害和残留，长期拌料喂养可以提高免疫力，促进畜禽和鱼类生长，改善肉产品的品质，是理想的抗生素等兽药的替代品。饲料添加剂的类型也由单一的成分向多种有效成分混合型的饲料添加剂发展，相对于市场上种类繁多的饲料添加剂产品，质量监管部门提供的检测方法显得有些不足，这给饲料添加剂质量监管带来许多不便，因此有必要对各种新型饲料添加剂的检测方法进行开发和研究。

本实验研究对象为以山苍子（Litsea cubeba）鲜果为原料提取出的山苍子油（Litsea cubeba oil）为主要活性物，以碳酸氢钙为载体，以大豆油（或其他同类型植物油）为稀释剂按照一定比例混合均匀而成的饲料添加剂。山苍子果油是一种天然植物精油，在日化、食品、医药、生物农药等方面有着广泛的应用。山苍子果油具有对大肠杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌等具有中、高度抑制作用，对多种真菌具有抑制作用且能降解黄曲霉素同时具有温暖脾肾及健胃消食的功能，用作饲料添加剂可以治疗动物的某些疾病，增强动物的免疫力，提高配合饲料的转化率，且能改善畜禽和鱼类的肉品质，是农业部《饲料添加剂使用目录（2013）》允许使用的饲料添加剂之一。山苍子果油组成较为复杂目前已发现的有20多种，其主要成分为柠檬醛（橙花醛和香叶醛）、柠檬烯、甲基庚烯酮等。对山苍子果油的组成及其活性物的作用，国内学者已经开展了一定的研究，但对山苍子果油作为饲料添加剂的应用方面研究成果比较少，主要是集中在山苍子油防霉抑菌应用方面，对山苍子果油作为饲料添加剂的检测方法尚未见文献报导。本研究开发出气相色谱法(GC-FID) 检测山苍子果油饲料添加剂中的特征组分甲基庚烯酮（cas no 110-93-0）、柠檬烯（cas no 5989-27-5）、橙花醛(cas no 141-27-5)、香叶醛 (cas no 5392-40-5)（各化合物的分子结构式见图1）。并对目标化合物采用气相色谱串联质谱法（GC/MS）进行确证。实验表明该方法准确快捷，可以用于山苍子果油混合饲料添加剂的检测。

图1 本实验目标化合物的分子结构式

1 实验部分

1.1 仪器与设备

气相色谱仪带自动进样系统联FID检测器及配套工作站（日本SHIMADZU 公司），石英毛细管柱（ZB-5，30m×0.32mm×0.25μm），美国Agilent 公司。6890N/5975N气相色谱－质谱联用仪，美国Agilent 公司；ZB-5MS 石英毛细柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），美国Agilent 公司.BT224S分析天平，德国 Sartorius公司；XH－B 旋涡混均器，江苏康健医疗用品有限公司；调速多用振荡器（上海永研超声设备有限公司），高速冷冻离心机（美国 BeckmanCoulter 公司），10mL 具塞玻璃比色管，50mL具塞塑料离心管。

1.2 材料与试剂

乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈均为分析纯，甲基庚烯酮标准品纯度大于99.0%，D- 柠檬烯标准品纯度大于98%，橙花醛标准品纯度大于98%，香叶醛标准品纯度大于98%,以上4 种标准品均购自德国Dr. Ehrenstorfer 公司。称取一定量的标准品，用乙酸乙酯溶解转移到容量瓶中，并逐级稀释成实验所需的浓度，再配制成相应浓度的混标。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

进样口温度：250 ℃；色谱柱升温程序：50 ℃保留 2 min，10 ℃/min 升至 150 ℃，20℃ /min 升至250 ℃保留 2min。检测器（FID）温度：280℃；载气；氮气（纯度不小于99.999%）；燃气；氢气（纯度不小于99.99%）；空气（压缩空气）；气体流量：柱流量，2.0 mL/min；氢气 40 mL/min；空气，400 mL/min；尾吹气，30 mL/min；进样量：1μL；分流比：30∶1。

1.3.2 样品前处理

准确称取样品1g（精确到0.0001g），置于塑料离心管中，加入4mL 乙酸乙酯涡旋混匀后，在调速振荡器上以120 次/min 条件下振摇提取 5min, 经过5000r/min 离心3min 后，吸取上清液于具塞刻度管中，重复上述实验一遍，再加入2mL 无水乙醇按照上述步骤操作一遍。定容到10mL，摇匀，在-18℃条件下速冻 1 小时，过 0.45μm 有机相滤膜后，上机测定。

1.3.3 测定

在上述选定的色谱条件下，待仪器稳定后，进行样品空白、标准溶液和试样溶液气相色谱分析。

2 结果与分析

2.1 气相色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

色谱柱是影响检测组分分离效果的主要因素，因此实验所选择色谱柱固定相类型，目标化合物的化学结构和组分极性是本文主要考虑的因素，根据相似相溶原则，本实验目标化合物均为弱极性，所以弱极性色谱柱为本实验首选色谱柱。同时兼顾研究对象为山苍子果油、碳酸氢钙、大豆油（其他植物油）等经过加工混合而成的因素。因此选择色谱柱除了要考甲基庚烯酮、D-柠檬烯、橙花醛、香叶醛的分子结构外，还考虑减少基质的干扰等因素。本实验采用了弱、中、强3 种不同极性的色谱柱，分别为ZB-5、ZB-35，ZB-WAX 毛 细 管色谱柱，综合考虑灵敏度、峰形、分析时间、基线漂移等色谱分析因素，ZB-5 毛细管色谱柱效果最好，因此以ZB-5 毛细管色谱柱作为本试验用色谱柱。

2.1.2 柱温和柱流量的优化及气相色谱方法的确定

在确定优选色谱柱后，气相色谱法中能够影响目标化合物分离效果的因素主要为色谱柱的升温程序和色谱柱的气体流量。由于甲基庚烯酮、D- 柠檬烯、橙花醛、香叶醛之间的沸点差异较大，同时考虑溶剂聚焦等因素，本研究反复实验比较了不同的初始温度、升温速率、柱流量后，确定仪器参数为：进样口温度：250 ℃；色谱柱升温程序:50 ℃保留 2 min，10 ℃ /min 升至150 ℃，20℃ /min 升至 250 ℃保留 2min。检测器 （FID） 温度280℃，分别取空白基质样品，标准品和混合饲料添加剂样品按上述前处理方法制备的溶液，按确定的色谱条件测定。结果空白基质样品在目标化合物保留时间处无杂质峰干扰，见图2、图3和图4，表明样品中其他成分不干扰目标化合物测定，并且能够在最短的时间实现目标化合物完全分离，方法特异性强，适用于山苍子果油混合型饲料添加剂甲基庚烯酮、D- 柠檬烯、橙花醛、香叶醛含量测定。

图2 空白基质气相色谱图

图3 空白基质加标气相色谱图

图4 山苍子果油饲料添加剂产品气相色谱图

表1 不同溶剂对阳性样品提取效果比较（n=6）

表2 四种目标化合物线性方程及定量限

2.2 前处理技术的选择

2.2.1 提取溶剂的选择

本研究实验采用了乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈作为样品的提取溶剂，对饲料添加剂样品进行提取实验（n=6）,实验表明乙酸乙酯对4 种目标化合物的提取效果最为理想，所以本研究实验选择乙酸乙酯作为提取溶剂（见表1）。

2.2.2 提取溶剂体积和提取次数

样品中目标化合物经过一次4 mL 提取5min 后，可以实现回收率80%以上，第二遍提取后回收率略有升，第三遍提取对回收率影响已经不显著，因此本实验采用提取三遍的方法及提取时间可以满足检测要求。

2.3 方法学考察

2.3.1 方法的线性范围及定量限

将甲基庚烯酮、D- 柠檬烯、橙花醛、香叶醛混合标准溶液配制 为 0.010、0.10、0.50、1.0、5.0、10.0mg/mL 系列标准工作溶液在上述的气相色谱条件下进样分析，以标准溶液浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，拟合标准曲线，结果表明4 种目标化合物在（0.01～10.0）mg/mL 范围内均有良好线性，以三倍信噪比（S/N=3） 为 检 出 限（LOD），S/N=10 为定量限（LQD）得到相应定量限在（0.2～0.4）mg/kg 之间，能够满足饲料添加剂的检测需求（结果见表2）。

2.3.2 方法的回收率和精密度

向空白基质样品中分别添加Ⅰ( 5g/kg) 、Ⅱ( 10g /kg) 、Ⅲ(50g/kg)三个浓度水平的混合标样，每个水平进行6 次平行测定，回收率和精密度结果见表3。

表3 加标回收实验结果(n =6)

表4 样品溶液稳定性 （单位：g/kg）

图5 空白基质加标四种目标化合物标准品的总离子流图

图6 山苍子果油混合型饲料添加剂产品总离子流图

图7 四种目标化合物质谱图

2.4 溶液稳定性试验

按上述的前处理方法制备样品溶液，用空白基质配制目标化合物浓度为50g/kg 的混合样品溶液，按前述方法测定四种目标化合物含量，样品溶液密封保存在室温环境中，隔 2、4、8、24、48h 测定含量，结果见表4，结果表明样品溶液在48h 内稳定。

3 GC/MS 确证

同时称取山苍子果油混合型饲料添加剂产品2 份及样品空白2 份，并在空白基质中添加浓度为50 mg/kg 水平的混标，按1.3.2 进行前处理后上机检测。

质谱条件：载气为高纯氦气，流速为1.5mL/min；采用分流进样，分流比为40∶1；进样口温度为 250℃，50 ℃保留 2 min，10℃ /min 升至 150 ℃，20℃ /min升至250 保留2min。离子源为EI 源；电子能量为70eV；传输线温度270 ℃；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；溶剂延迟5min。采用Scan 扫描模式，50～500 m/z 扫描。总离子流图和质谱图见图5 和图6。

图8 山苍子果油混合型饲料添加剂产品气相色谱图

4 实际样品测定

对企业生产的山苍子果油混合型饲料添加剂进行测定，准确称取样品 1g （精确至0.0001g），按照 1.3.2 前处理方法实验。采用 GC-FID 测定，色谱谱图见图7、图8，测定结果与产品明示值相符。

5 结论

本研究建立的气相色谱法测定山苍子果油混合饲料添加剂中甲基庚烯酮、D- 柠檬烯、橙花醛、香叶醛含量的方法，该方法具有前处理技术简单和强特异性优点，有较宽的线性范围和显著的线性关系，加标回收率高，重现性好，所使用仪器设备普及率高，可在山苍子果油混合型饲料添加剂中甲基庚烯酮、D-柠檬烯、橙花醛、香叶醛的质量检测及标准制定中加以推广应用。

参考文献：(略）