豆粕固态发酵及酶解制备小分子肽的研究

◆作者：闫凯 周玉岩 陈子龙 冯蓓 吴先纯

随着全球经济发展和生活品质的提升，人们对鱼、肉、蛋、奶等蛋白类产品需求量日益增加，这推动了畜牧、水产养殖业的快速发展，进而推动饲料行业总产量的增加。饲料中蛋白质含量一般为25%～50%，主要来源为动物蛋白（鱼粉为主），但由于动物蛋白品质容易受原料来源地、运输存贮条件和加工处理方法的影响，因而饲喂效果千差万别。另外，全球动物源蛋白资源日益匮乏，饲料企业需求量日益增加，蛋白供应缺口问题凸显，引发原料价格不断上涨，饲料生产成本增加。因此，寻找其他蛋白原料替代动物蛋白迫在眉睫，也为开发新的蛋白源产品提供了良好机遇。

豆粕是大豆经压榨提油后产生的一种农副产品，其蛋白质含量一般为30%～50%，富含氨基酸，必需氨基酸平衡性好，营养组分接近动物蛋白，可满足动物生长需求，是一种容易获取、生产周期短、价廉质优的植物蛋白。但是豆粕蛋白质分子结构复杂，有α-螺旋、β- 折叠等，一般由四级结构组成，且80%的蛋白质相对分子质量在10 万道尔顿以上；高度压缩、折叠等复杂分子结构使得大豆蛋白质的消化率和生物利用率大幅度下降，因此原料体外预消化非常重要。米曲霉是美国食品与药物管理局（FDA）和美国饲料协会公布的40 余种安全微生物菌种之一，是中国饲料添加剂品种目录中一员，是一种被世界公认的无害发酵用微生物菌种。米曲霉具有丰富的蛋白酶系，能够分泌多种胞外蛋白酶，且以中性蛋白酶为主（该酶在豆粕蛋白酶解中发挥主要作用），另外还含有酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、糖化酶、谷氨酰胺酶等，能耐受较高温度，抗逆性强，广泛地应用于饲料加工、环境处理、食品及医药等工业中。

本实验以豆粕为原料，经米曲霉固态发酵制曲、曲料酶解等一系列体外消化处理后喷雾干燥得到营养指标高、容易消化的小分子肽产品，是豆粕蛋白深度开发利用新方式，具有替代或部分替代动物蛋白潜能，可减少对动物蛋白的依赖程度，同时对饲料加工生产过程中降低生产原料成本具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

米曲霉：沪酿3.042，山东淄博沂源康源生物科技有限公司；带皮豆粕（粗蛋白质43%）：东莞嘉吉油粮有限公司；酪蛋白：北京百灵威科技有限公司；酪氨酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；福林酚：国药集团化学试剂有限公司；碳酸钠、浓硫酸、硫酸铜、氢氧化钠等其他试剂，均为分析纯。

1.1.2 试验仪器与设备

SDS-III 单胃动物仿生消化系统：湖南中本智能科技有限公司；UV-1700 紫外分光光度计：日本岛津；恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；HZQ-X100恒温振荡培养箱：常州市华怡仪器制造有限公司；高速台式离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；全自动定氮仪：上海纤检仪器有限公司；万分之一电子天平：梅特勒- 托利多仪器（上海）有限公司；恒温磁力搅拌器：常州国华电器有限公司；pH 酸度计PB-10：赛多利斯；6 米圆盘制曲机：上海振良食品有限公司；5000L 酶解罐：南京汇科生物工程设备有限公司；喷雾干燥塔：江苏省范群干燥设备有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 豆粕固态发酵

带皮豆粕→加自来水绞龙润 水 至 50% →115℃ 蒸 煮15min→冷却至 35～40℃温度范围→接米曲霉菌种（按原料量的千分之一）→皮带输送至圆盘制曲机内→28～30℃通风好氧固态发酵→中性蛋白酶活测定→低温干燥→粉碎，备用。

1.2.2 试验设计

以氨基酸态氮生成率为考察指标，500mL 三角瓶为酶解反应容器，采用单因素试验进行酶解探索，确定最佳酶解条件。底物浓度依次为10%、15%、20%、25%，酶解温度依次为35℃、40℃、45℃、50℃，酶解时间依次为 8h、16h、24h、32h、40h。

1.2.3 酶解方法及后处理

豆曲粉碎后加入适量比例自来水混匀→调节物料温度→密闭容器中匀速搅拌，恒温酶解→取酶解液进行测定→95℃加热灭活10min→高温喷雾干燥→产品检测。其中酶解时，每隔8h 取样，测定其氨基酸态氮含量。

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 酶活力测定

酶活力测定采用福林酚法并略作修改。酶活力单位定义：40℃温度和 pH=7.5 条件下，1min 水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸所需要的酶量定义为1 个蛋白酶活力单位U，以U/g 表示。

1.2.4.2 氨基酸态氮、粗蛋白、酸溶蛋白测定

氨基酸态氮测定采用甲醛滴定法，每次测定精准取样2.00g；粗蛋白质和酸溶蛋白测定采用凯氏定氮法，其中粗蛋白质测定精准取样0.50g，酸溶蛋白取样2.00g。

2 结果与讨论

2.1 豆粕固态发酵制曲外观形态及中性蛋白酶酶活变化情况

图1 为圆盘制曲机内部结构及物料分布情况。图2 为豆粕固态发酵制曲12 小时，此时物料表面发白，长满米曲霉菌丝体，菌体生长旺盛，产生大量生物热。

图1 圆盘内部及物料分布

图2 发酵12 小时后物料外观

图3 圆盘制曲过程中曲料中性蛋白酶酶活力变化曲线图

发酵过程中，米曲霉分泌中性蛋白酶的多少直接影响豆粕蛋白酶解生成氨基酸态的效率，因此产酶时段控制很重要。由图3 可知，豆粕发酵制曲过程中，一定时间范围内中性蛋白酶酶活力随着发酵时间的增加而上升。0-12 小时，酶活基本没有，这是因为发酵前期米曲霉主要进行孢子发芽和菌丝体生长，几乎不合成分泌中性蛋白酶。12～36 小时，中性蛋白酶活开始合成分泌出胞外，培养36 小时产酶达到顶峰，2457U/g，与张杰、樊君报道一致。随着培养时间的延长，中性蛋白酶活性不再增加，可能是发酵后期菌丝体形成米曲霉孢子体，不再合成分泌中性蛋白酶。

2.2 底物浓度对氨基酸态氮生成率的影响

由图4 可知，豆曲酶解时底物浓度对氨基酸态氮生成率有一定影响。当底物浓度为10%～20%时，随着底物浓度的增加，氨基酸态氮的生成率变化趋势一致，其中10%底物浓度最高生成率6.82g/100g（干基，下同），15%底物浓度的为6.67g/100g，20%底物浓度的为6.45g/100g。但随着底物浓度的继续增加，当浓度为25%时，酶解液中氨基酸态氮生成率大幅度降低，最高为4.72g/100g，可能底物浓度过高，物质粘稠，流动性差，影响酶分子接触物料效率及酶解反应速率。根据企业生产实际情况，结合环保节能减排要求及后续喷雾干燥动力成本，选用20%底物浓度进行后续试验。

2.3 酶解温度对氨基酸态氮生成率的影响

图4 底物浓度对氨基酸态氮生成率的影响

图5 酶解温度对氨基酸态氮生成率的影响

由图5 可知，酶解温度对氨基酸酸态氮生成率有明显影响。随着酶解温度的升高，酶解液中氨基酸态氮含量呈现先增加后降低趋势。当酶解温度为35℃-40℃时，随着温度的增加，酶解液中氨基酸态增加明显，其中40℃对应的氨基酸态氮生成率为 6.45g/100g（干基，下同）；当酶解温度为40℃-50℃时，氨基酸态氮生成率均有降低，其中45℃最高氨基酸态氮生成率为6.05g/100g，50℃为 3.85g/100g。导致上述现象的原因与中性蛋白酶的最适酶解温度有关，该酶最适温度一般为40～45℃。在适宜的温度范围内，随着温度升高，酶活性增强，酶解反应速度加快，氨基酸态氮生成率增加；但温度过高，酶活性降低，稳定性差，衰减快，从而影响蛋白质酶解度，导致氨基酸态氮生成率低。

2.4 酶解时间对氨基酸态氮生成率的影响

由图6 可知，酶解时间对氨基酸态氮生成率有明显影响，酶解过程中呈现先增后平稳的趋势。酶解时间0-8 小时，酶解液中氨基酸态氮生成；酶解8～32 小时，酶解液中氨基酸态氮含量继续增加，最高为6.45g/100g；当酶解时间大于32 小时后，氨基酸态氮生成率开始趋向平稳。导致上述现象的原因是豆粕中蛋白质氨基酸肽链具有多种酶切割位点，蛋白酶的催化酶解反应具有高度专一性，故反应进行到一定程度时，中性蛋白酶酶切位点以外的其他非特异酶切位点不能被切割，不再释放氨基酸和小肽。

图6 酶解时间对氨基酸态氮生成率的影响

2.5 中试酶解及喷雾干燥

采用公司现有5 吨酶解罐，装载体积70%，底物浓度20%，40℃条件下酶解32 小时，酶解液氨基酸态氮为1.33g/100g，氨基酸态氮生成率6.65g/100g（干基），高于上述三角瓶试验，这是因为酶解罐反应控制精准，酶解条件好原因。酶解反应结束后，酶解液升温灭活进行喷雾干燥。喷雾干燥条件：入风温度200℃，出风温度85℃。喷雾干燥产品经检测后，粗蛋白含量52.83%，小分子肽（酸溶蛋白）含量36.16%，氨基酸态氮6.32%，猪仿生蛋白质消化率82.26%，远高于豆粕原料。

3 结论

本试验以米曲霉沪酿3.042为发酵菌种，豆粕为原料制曲，探讨制曲后曲料酶解过程的各种因素，得到如下结论：酶解底物浓度20%，酶解温度40℃，酶解时间32 小时，酶解液氨基酸态氮含量为1.33g/100g，氨基酸态氮生成率为6.65g/100g（干基）。酶解液喷雾干燥入风温度200℃，出风温度85℃，得到小分子肽产品粗蛋白含量52.83%、酸溶蛋白36.16%，氨基酸态氮6.32%，猪仿生蛋白质消化率82.26%。该小分子肽粉易消化，具有较高的营养价值，为豆粕资源蛋白的开发利用提供新方式与参考，用于饲料生产替代或部分替代鱼粉将有广阔的前景。

参考文献：（略）