陕产长春七挥发油提取工艺优化及抗氧化活性研究

侯敏娜，侯少平，许海燕，刘艳红，王 珊，赖普辉

(陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712046)

长春七，又名长虫七，为伞形科植物岩风[Libanotisbuchtorimensis(Fisch.)Dc.]的根，在《全国中草药汇编》《秦岭植物志》《陕西中草药名录》中都有记载，是陕西“太白七药”中八大金刚之一。长春七野生于秦岭山区，甘肃、四川也有分布，以太白山产长春七质地最优，其性甘、温，味苦，具有疏风散寒、祛风除湿、活络止痛的功效，主要用于风寒感冒、周身疼痛、关节肿胀、跌打损伤等疾病的治疗。长春七主要含有香豆素类、萜类、挥发油及酯类等多种化学成分[1-3]。现代药理研究表明，长春七具有镇痛、抗炎、抗菌等活性[4-5]，而国内外大部分文献仅报道了其挥发油抑菌作用。经查阅相关文献，植物中挥发油具有一定的抗氧化作用。鉴于此，作者以挥发油提取率为评价指标，采用单因素实验和响应面法实验优化陕产长春七挥发油的超声提取工艺，并考察长春七挥发油对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力，评价其抗氧化活性。拟为合理开发利用太白山区这一特有药用资源提供理论基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

长春七，2018年采自于陕西省宝鸡市眉县，经陕西国际商贸学院中药教研室雷国莲教授鉴定为伞形科植物岩风[Libanotisbuchtorimensis(Fisch.)Dc.]的根。

乙醚，天津天力化学试剂有限公司；正己烷，广东省化学试剂工程技术研究开发中心；石油醚、乙醇，天津河东区红岩试剂厂；无水硫酸钠，天津盛奥化学试剂有限公司；所用试剂均为分析纯。

KQ5200DE型台式数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵，李仓区恒通兴达仪器仪表商行；RE-52型系列旋转蒸发仪，巩义瑞力仪器设备有限公司；KQ-A型玻璃仪器气流烘干器，北京中兴伟业仪器有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 长春七挥发油的提取

将长春七切碎，在40 ℃充分干燥后，粉碎过80目筛。准确称取4份长春七粉末各1.000 0 g，分别置于编号为A、B、C、D的锥形瓶中，依次分别加入60 mL的乙醚、石油醚、正己烷、无水乙醇，摇匀，在一定条件下超声处理一定时间，加入一定量的无水硫酸钠(以不产生结晶为度)，过滤、浓缩、低温干燥、称重，按式(1)计算挥发油提取率[6-9]：

(1)

式中：m1为干燥至恒重后的蒸发皿与长春七挥发油的总质量，g；m2为干燥至恒重后蒸发皿的质量，g；m为干燥的长春七粉末质量，g。

1.3 单因素实验[7，9]

1.3.1 提取溶剂对长春七挥发油提取率的影响

在超声功率为160 W、超声温度为25 ℃、料液比为1∶60(g∶mL，下同)、超声时间为20 min的条件下，考察不同提取溶剂(乙醚、石油醚、正己烷、无水乙醇)对长春七挥发油提取率的影响。

1.3.2 料液比对长春七挥发油提取率的影响

在超声功率为160 W、超声温度为25 ℃、超声时间为20 min、提取溶剂为乙醚的条件下，考察不同料液比(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70)对长春七挥发油提取率的影响。

1.3.3 超声时间对长春七挥发油提取率的影响

在超声功率为160 W、超声温度为25 ℃、料液比为1∶50、提取溶剂为乙醚的条件下，考察不同超声时间(10 min、15 min、20 min、25 min、30 min)对长春七挥发油提取率的影响。

1.3.4 超声温度对长春七挥发油提取率的影响

在超声功率为160 W、超声时间为20 min、料液比为1∶50、提取溶剂为乙醚的条件下，考察不同超声温度(15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃)对长春七挥发油提取率的影响。

1.4 响应面法实验

在单因素实验的基础上，选取对长春七挥发油提取率影响显著的3个因素料液比(X1)、超声时间(X2)和超声温度(X3)，采用Box-Behnken中心组合方法设计3个水平进行响应面法实验，因素与水平见表1。

表1 响应面法实验的因素与水平

1.5 长春七挥发油的抗氧化活性研究[10-13]

1.5.1 DPPH自由基清除活性的测定

1.5.1.1 溶液的配制

DPPH自由基溶液的配制：精密称量2 mg DPPH自由基置于100 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，得浓度为0.02 mg·mL-1的DPPH自由基溶液，避光保存。

长春七挥发油溶液的配制：分别准确称取长春七挥发油0.08 g、0.10 g、0.12 g、0.14 g、0.16 g、0.18 g，用无水乙醇定容，得浓度分别为0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1、1.4 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1、1.8 mg·mL-1的长春七挥发油溶液，备用。

1.5.1.2 长春七挥发油对DPPH自由基清除活性的测定

取2 mL不同浓度的长春七挥发油溶液，分别注入2 mL DPPH自由基溶液，振荡摇匀后于避光处静置30 min，测定517 nm处吸光度。以无水乙醇作为空白对照。按式(2)计算DPPH自由基清除率：

(2)

式中：A0为2 mL DPPH+2 mL无水乙醇的吸光度；A1为2 mL DPPH+2 mL样品溶液的吸光度；A2为2 mL无水乙醇+2 mL样品溶液的吸光度。

1.5.2 ABTS自由基清除活性的测定

1.5.2.1 溶液的配制

ABTS+溶液的配制：准确称取K2S2O80.013 4 g，加入适量蒸馏水，超声使其充分溶解，定容，配成浓度为2.45 mmol·L-1的K2S2O8水溶液；准确称取ABTS 0.038 4 g，加入适量纯水，超声使其充分溶解，定容，配成浓度为7 mmol·L-1的ABTS水溶液；然后将上述两种溶液混合反应，避光放置12～14 h后得ABTS+母液。使用时将ABTS+母液用无水乙醇稀释，使其在734 nm处吸光度在0.7左右。

长春七挥发油溶液的配制：分别准确称取长春七挥发油0.10 g、0.15 g、0.20 g、0.25 g、0.30 g、0.35 g，用无水乙醇定容，得浓度分别为1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1、3.5 mg·mL-1的长春七挥发油溶液，备用。

1.5.2.2 长春七挥发油对ABTS自由基清除活性的测定

取2 mL不同浓度的长春七挥发油溶液，分别加入2 mL稀释后的ABTS+溶液，摇匀，避光保存30 min，测定734 nm处的吸光度。以无水乙醇作为空白对照。按式(3)计算ABTS自由基清除率：

(3)

式中：A3为2 mL ABTS++2 mL无水乙醇的吸光度;A4为2 mL ABTS++2 mL样品溶液的吸光度；A5为2 mL无水乙醇+2 mL样品溶液的吸光度。

1.6 数据处理

采用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行处理分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取溶剂对长春七挥发油提取率的影响(图1)

图1 提取溶剂对长春七挥发油提取率的影响Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction rate of volatile oil from Libanotis buchtorimensis

由图1可知，以乙醚、石油醚、正己烷、无水乙醇为提取溶剂时，长春七挥发油提取率分别为14.87%、14.28%、13.00%和10.39%，其中提取溶剂为乙醚时，提取率最高。故选择乙醚为提取溶剂。

2.1.2 料液比对长春七挥发油提取率的影响(图2)

图2 料液比对长春七挥发油提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of volatile oil from Libanotis buchtorimensis

由图2可知，随着料液比的减小，即提取溶剂用量的增加，长春七挥发油提取率呈先升高后降低的趋势；当料液比为1∶50时，长春七挥发油提取率最高。这可能是由于，挥发油在一定料液比范围内趋于饱和，同时当溶剂用量过多时，经加热沸腾，原料和挥发油会出现沾壁现象，从而降低提取率。故选择料液比为1∶50。

2.1.3 超声时间对长春七挥发油提取率的影响(图3)

图3 超声时间对长春七挥发油提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of volatile oil from Libanotis buchtorimensis

由图3可知，当超声时间为20 min时，长春七挥发油提取率最高；继续延长超声时间，长春七挥发油提取率明显下降。这可能是由于，当超声时间较长时，长春七挥发油中的有效成分挥发或者分解。故选择超声时间为20 min。

2.1.4 超声温度对长春七挥发油提取率的影响(图4)

图4 超声温度对长春七挥发油提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of volatile oil from Libanotis buchtorimensis

由图4可知，随着超声温度的升高，长春七挥发油提取率呈先升高后降低的趋势；当超声温度为25 ℃时，长春七挥发油提取率最高。这可能是由于，超声温度过高，会使长春七挥发油中有效成分挥发或者分解，导致提取率降低。故选择超声温度为25 ℃。

2.2 响应面法实验结果

2.2.1 二次回归模型建立和方差分析

以长春七挥发油提取率为响应值，在单因素实验的基础上，按照响应面Box-Behnken的设计原理，设计17组实验，结果见表2。

表2 响应面法实验设计及结果

对该模型进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，回归模型的R2=0.9625，表明长春七挥发油提取率的实验值与预测值有较好的拟合度。然而，通过对比其各因素影响程度可知，料液比(X1)的一次项、二次项较显著，超声时间(X2)的二次项极显著，说明料液比和超声时间对长春七挥发油提取率的影响较大。失拟项不显著，说明可以使用这些因素对长春七挥发油提取率进行初步预测以及分析。同时由F值可知，各因素对长春七挥发油提取率影响的大小顺序为：料液比>超声时间>超声温度。

2.2.2 交互作用分析

表3 响应面回归模型的方差分析

根据模型绘制响应面图，结果见图5。

由图5a可知，料液比与超声时间的曲面均有坡度，且超声时间的曲面坡度更陡，表示超声时间的二次项对长春七挥发油提取率有明显的影响，而料液比对其的影响略小。由图5b可知，超声时间的坡面比超声温度的坡面陡，说明超声时间的二次项对长春七挥发油提取率的影响大于超声温度。由图5c可知，料液比的曲面坡度较陡，说明料液比的二次项对长春七挥发油提取率的影响比较显著。由图5得到因素的合理水平范围为：料液比1∶(50～60)，超声时间20～25 min，超声温度25～30 ℃。

求导得到长春七挥发油最佳提取工艺为：料液比1∶52.73、超声时间20.37 min、超声温度26.13 ℃，在此提取条件下，长春七挥发油提取率的理论值为13.641 6%。综合考虑，将各因素修正为：料液比1∶53、超声时间20 min、超声温度26 ℃。在此条件下，平行进行3次放大实验，经计算可得挥发油提取率为13.639 2%，与理论值差值为0.002 4%，说明此方法可行，可用于长春七挥发油的提取。

图5 各因素交互作用的响应面图Fig.5 Response surface map for interaction between each factors

2.3 长春七挥发油抗氧化实验结果

2.3.1 长春七挥发油清除DPPH自由基能力(图6)

图6 长春七挥发油对DPPH自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of DPPH free radicals by Libanotis buchtorimensis

由图6可知，DPPH自由基清除率随长春七挥发油溶液浓度的增大呈升高趋势，表明长春七挥发油对DPPH自由基有清除效果，其具有一定程度的抗氧化活性。在0.8～1.8 mg·mL-1浓度范围内，清除率与浓度呈线性关系(R2>0.98)，拟合效果较好，两变量相关性强。在此条件下，长春七挥发油清除DPPH自由基线性范围在1.4～1.8 mg·mL-1为最佳。

2.3.2 长春七挥发油清除ABTS自由基能力(图7)

由图7可知，ABTS自由基清除率随长春七挥发油溶液浓度的增大呈升高趋势，表明长春七挥发油对ABTS自由基具有一定的清除能力，其具有一定程度的抗氧化活性。在1.0～3.5 mg·mL-1浓度范围内，清除率与浓度呈线性关系(R2>0.99)，拟合度较高，

图7 长春七挥发油对ABTS自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of ABTS free radicals by Libanotisbuchtorimensis

且两变量相关性较强。在此条件下，长春七挥发油清除ABTS自由基线性范围在2.5～3.5 mg·mL-1为最佳。

3 结论

以挥发油提取率为评价指标，采用单因素实验和响应面法实验优化陕产长春七挥发油的超声提取工艺，并考察了长春七挥发油对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力。确定长春七挥发油的最佳提取工艺为：以乙醚为提取溶剂、料液比1∶53 (g∶mL)、超声时间20 min、超声温度26 ℃。在此提取工艺条件下， 经3次平行放大实验验证，得长春七挥发油提取率为13.639 2%，与理论值(13.641 6%)较为接近，说明此方法具有可行性和合理性。长春七挥发油在一定的浓度范围内，对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率随其浓度的增大而升高，且呈一定的量效关系；长春七挥发油清除DPPH自由基线性范围在1.4～1.8 mg·mL-1为最佳，长春七挥发油清除ABTS自由基线性范围在2.5～3.5 mg·mL-1为最佳。该研究为进一步有效开发利用陕西“太白七药”提供了一定的理论基础。