白及须根多酚提取工艺优化及其抗氧化、酪氨酸酶抑制活性研究

陈向阳，宋 武，檀小菲，王婷婷，耿玉闯，王卫东，康清俊，吴永祥*

1黄山学院 生命与环境科学学院，黄山 245041；2黄山峰源生物科技有限公司，黄山 245600；3黄山荷琇生物科技有限公司，黄山 245000

白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.P.E是兰科(Orchidaceae)白及属植物，为传统珍贵中药材，主产于云南、贵州、安徽、四川、湖北、河南、浙江等地。白及药用历史悠久，具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤和创伤治愈等作用，可用于治疗咯血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等症状[1-3]。本课题组前期研究表明[4,5]，白及块茎的不同极性萃取物具有显著的抗氧化、抑菌和α-淀粉酶抑制作用，采用GC-MS进行化学成分分析，揭示白及发挥作用的物质基础是其多酚类物质。白及的块茎是作为传统的药用部位，在实际的采挖过程中，白及的须根被刨除而弃之不用，然而白及须根与块茎的比例高达1∶4～1∶3，资源被大量浪费[6]。据统计，2017年全国白及种植面积为2 600 km2，白及总产量约3 500 t，白及须根副产物高达了1 000 t[7]。研究发现[8-10]，白及块茎及其须根富含结构相同或相似的化学物质，其中有些活性成分如多酚、多糖等在须根中的含量远高于块茎，甚至某些联菲类成分仅存在于须根中，具有优于块茎的抑菌、抗菌、抗肿瘤等药理作用。

酪氨酸酶(tyrosinase)是一种结构复杂的含二价铜离子的金属酶，广泛存在动植物、微生物以及人体，与果蔬酶促褐变和人体皮肤黑色素的形成密切相关[11]。酪氨酸酶抑制剂能够用于化妆品、医药和食品工业等领域。甘油具有低毒性、低成本和无需去除溶剂等优点，相比于甲醇、丙酮和乙醇等有机提取溶剂，被视为绿色溶剂，已被应用于植物中木质素、黄酮类和多酚类化合物的提取[12]。目前，国内外学者对白及须根的研究都是基于化学成分鉴定及功效评价，对白及须根多酚提取工艺优化的研究仍然缺乏，白及须根多酚的抗氧化、酪氨酸酶抑制作用研究尚未见报道。为合理开发与利用白及须根资源，本研究采用甘油为提取溶剂，联合高剪切分散乳化技术，在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken 设计方法对 BRP 提取量的二次回归模型进行分析，采用响应面设计实验对BRP提取工艺进行优化，确定BRP的最佳的提取条件，并探讨BRP的体外抗氧化、酪氨酸酶抑制效果。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

白及须根，由黄山峰源生物科技有限公司提供，2018年5月于安徽省祁门县采集；甘油(丰益油脂化学(上海)有限公司)；酪氨酸酶(tyrosinase，50 000 units)、左旋多巴、丹宁酸(tannic acid，TA)、维生素C(Vc)(Sigma-Aldrich公司)；福林酚试剂、DPPH、ABTS(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.2 仪器

FE28-standard型精密pH计(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司)；AR124CN型电子天平(奥豪斯仪器(常州)有限公司)；A25型高剪切分散乳化机(上海弗鲁克流体机械制造有限公司)；SpectraMax-190型全波长酶标仪(美国Molecular Devices公司)；EV341型旋转蒸发仪(北京莱伯泰科仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 高剪切分散乳化技术辅助甘油提取白及须根多酚

将白及须根洗净、晾干，置于55 ℃烘箱中干燥至恒重，用高速粉碎机进行破碎，过80目筛，得到白及须根粉末。取白及须根粉末0.5 g，按照料液比1∶40 g/mL加入用蒸馏水稀释成体积分数为40%的甘油，用1 mol/L的盐酸溶液调节pH为5、温度为50 ℃，以16 200 rpm的转速剪切，时间设定为150 s进行提取，过滤后即得白及须根多酚提取液。

2.2 多酚含量测定

参考文献[4]，采用Folin-Ciocalteu 法测定白及须根中的多酚含量。以吸光值Y为纵坐标，TA浓度X为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程Y=0.001 3X+0.011(R2=0.993 1)。根据下列公式计算白及须根中的多酚含量：

(1)

式中，c：表示不同提取条件下待测液中多酚浓度，mg/mL；N：表示提取液到待测液的稀释倍数；V：表示提取液的体积，mL；m：表示白及须根的质量，为0.5 g。

2.3 单因素实验

2.3.1 甘油浓度对 BRP 提取量的影响

固定料液比为1∶40(g/mL)、pH为5、剪切时间为150 s、剪切转速为16 200 rpm、剪切温度为50 ℃，考察不同甘油体积分数(0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%)对BRP提取量的影响。

2.3.2 pH 对 BRP 提取量的影响

固定甘油浓度为40%、料液比为1∶40(g/mL)、剪切时间为150 s、剪切转速为16 200 rpm、剪切温度为50 ℃，考察不同pH值(3、4、5、6、7)对BRP提取量的影响。

2.3.3 剪切转速对 BRP 提取量的影响

固定甘油浓度为40%、料液比为1∶40(g/mL)、pH为5、剪切时间为150 s、剪切温度为50 ℃，考察不同剪切转速(10 600、13 400、16 200、19 000、21 800 rpm)对BRP提取量的影响。

2.3.4 剪切时间对 BRP 提取量的影响

固定甘油浓度为40%、料液比为1∶40(g/mL)、pH为5、剪切转速为16 200 rpm、剪切温度为50 ℃，考察不同剪切时间(90、120、150、180、210 s)对BRP提取量的影响。

2.3.5 剪切温度对 BRP 提取量的影响

固定甘油浓度为40%、料液比为1∶40(g/mL)、pH为5、剪切转速为16 200 rpm、剪切时间为150 s，考察不同剪切温度(30、40、50、60、70 ℃)对BRP提取量的影响。

2.3.6 料液比对 BRP 提取量的影响

固定甘油浓度为40%、pH为5、剪切转速为16 200 rpm、剪切时间为150 s、剪切温度为50 ℃，考察不同料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL)对BRP提取量的影响。

2.4 响应面实验设计

根据 Box-Behnken实验设计原理，以甘油浓度(A)、pH(B)、剪切转速(C)、剪切温度(D)四个显著影响因素作为变量，采用四因素三水平进行响应面实验设计，从而对提取工艺条件进行优化。实验设计与因素水平见表1。

表1 Box-Behnken实验设计

2.5 抗氧化活性的评价

ABTS自由基清除能力的测定参考文献[13]；DPPH自由基清除能力的测定参考文献[14]；还原能力的测定参考文献[13]。以VC为阳性对照。

2.6 酪氨酸酶抑制作用的测定

根据Lee等[15]的测定方法稍加改进，具体如下：向96孔板中依次加入50 μL 70 mM磷酸缓冲液(pH=6.8)、80 μL 10 mM的左旋多巴与50 μL不同浓度的 BRP(0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2 mg/mL)，混匀后于37 ℃恒温反应5 min。然后加入20 μL 125 unit/mL的酪氨酸酶溶液，37 ℃恒温反应15 min，在酶标仪中于475 nm波长处测定样品组吸光度值。以Vc水溶液为阳性对照，并按照下列公式计算酪氨酸酶抑制率：

(2)

式中，I：表示酪氨酸酶抑制率；AS：表示样品组吸光度值；ASB：表示样品对照组吸光值；AC：表示空白组吸光值；ACB：表示空白对照组吸光值。

2.7 数据的统计学分析

所得数据以平均值±标准差表示。采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析。采用Duncan’s多重比较法分析结果的差异显著性(P<0.05)。

3 结果与分析

3.1 单因素实验结果

3.1.1 甘油浓度对BRP提取量的影响

由图1所示，BRP 提取量随着甘油浓度的增加呈先增加后减少的趋势，当甘油浓度达到50%时，BRP 提取量达到最大，为15.85±0.42 mg/g，与未添加甘油组(10.15±0.17 mg/g)相比，多酚提取量增加了56.19%，存在着显著性差异(P<0.05)。这是因为甘油溶液的极性随甘油浓度的变化而变化，导致酚类化合物的溶解度不同，使得多酚提取量发生变化[12]。当甘油浓度过高时可能由于粘度过大影响多酚的提取，从而导致多酚提取量的降低。因此，选取甘油浓度40%～60%作为响应面实验参考因素。

图1 甘油浓度对BRP提取量的影响

3.1.2 pH对BRP提取量的影响

由图2所示，pH值在3～4范围时，BRP 提取量与pH呈现出正相关，当pH为4时，BRP 提取量达到最大值，为16.18±0.14 mg/g，存在着显著性差异(P<0.05)。当pH值大于4时，BRP 提取量与pH呈现出负相关。这可能由于白及须根多酚富含酚羟基，在较低酸性条件下，多酚性质较为稳定；当pH过大时，破坏了多酚的结构，从而导致多酚提取量的降低[16]。因此，选用pH值3～5作为响应面参考因素。

图2 pH对BRP提取量的影响

3.1.3 剪切转速对BRP提取量的影响

由图3所示，当剪切转速在10 600～16 200 rpm时，BRP提取量持续增加，在剪切转速为16 200 rpm时，BRP 提取量达到最大值，为15.72±0.27 mg/g，存在着显著性差异(P<0.05)。当剪切转速超过16 200 rpm时，BRP提取量不断下降。这可能由于剪切力过大，破坏了多酚类物质(如黄酮母核)的结构，从而影响了BRP的得率[17]。因此，选用剪切转速13 400～19 000 rpm作为响应面参考因素。

图3 剪切转速对BRP提取量的影响

3.1.4 剪切时间对BRP提取量的影响

由图4所示，剪切时间在90～150 s时，增加趋势较明显，在150 s时，BRP 的提取量达到最大，为15.73±0.23 mg/g，存在着显著性差异(P<0.05)。在150～210 s时，变化趋势平缓。这是因为高转速剪切使白及须根细胞壁被有效地破坏，让活性成分可以充分溶于溶液中，从而BRP的提取量得到增加[17]。因此，选用150 s作为后续实验的固定条件，但不作为响应面实验考察因素。

图4 剪切时间对BRP提取量的影响

3.1.5 剪切温度对BRP提取量的影响

由图5所示，温度在30～40 ℃时，伴随温度的升高 BRP 提取量迅速增加，当温度达到40 ℃时，BRP 提取量达到最大，为16.22±0.19 mg/g，存在着显著性差异(P<0.05)。当温度继续上升，BRP 提取量转而呈下降趋势，这与多酚类物质的热稳定性相关，高温条件下，多酚类成分会发生降解，导致多酚的含量的降低[18]。因此，选用温度30～50 ℃作为响应面参考因素。

图5 剪切温度对BRP提取量的影响

3.1.6 料液比对BRP提取量的影响

由图6所示，料液比在1∶20～1∶50 g/mL时，伴随料液比的升高，BRP提取量快速增加；当料液比继续增加，BRP 提取量增加不明显，料液比为1∶60 g/mL时，BRP 提取量达到最大，为15.97±0.68 mg/g。这是因为增加料液比，可以使样品与溶剂充分接触，促进更多活性物质溶于溶液中，有助于多酚提取率的提高[19]，当料液比在1∶50 g/mL时，已达到平衡，在继续增加料液比对多酚的提取量影响可以忽略不计。因此，可以选用1∶50 g/mL作为后续实验的固定条件，但不作为响应面实验考察因素。

图6 料液比对BRP提取量的影响

3.2 响应面实验结果

3.2.1 Box-Behnken实验设计与结果分析

单因素实验结果表明，提取条件为甘油浓度占50%、pH值为4、剪切转速为16 200 rpm、剪切时间为150 s、剪切温度为40 ℃、料液比为1∶50 g/mL时，白及须根多酚的提取量均达到最大。固定剪切时间150 s、料液比1∶50 g/mL的条件下，以白及须根多酚提取量为响应值(Y)，响应面分析方案与结果见表2。

表2 多酚提取的响应面实验结果

3.2.2 回归方程的建立与显著性检验

以白及须根多酚提取量为响应值(Y)，得到多酚提取量对各影响因素的二次多项式回归模型为：Y=19.06+0.58A+0.29B+0.30C+0.65D-0.58AB-0.65AC-0.26AD-0.59BC-0.095BD+0.018CD-0.77A2-0.64B2-0.80C2-0.69D2。

经统计学分析可知，该实验选用的模型极显著(P<0.01)，变异系数CV=2.46%<5%，说明模型实验预测性高、稳定性好。方差的失拟项不显著(P=0.579 5>0.05)，表明模型选择合适。因此，实验真实点对结果的分析可用回归方差进行代替。

据表 3 显示，在此实验设计中，一次项A、B、C和D对 BRP 提取量的影响均达到显著水平(P<0.05)。从显著性检验P值的大小可以得到各因素对 BRP 提取量影响的顺序为温度(D)> 甘油浓度(A)>剪切转速(C)>pH(B)。由图7可知，甘油浓度和pH、甘油浓度和剪切转速、pH和剪切转速的交互作用对BRP 提取量影响是显著的。

表3 回归模型方差分析

图7 因素交互作用对BRP提取量的影响

3.2.3 最佳工艺条件及验证实验

通过回归模型求解方程，得到最佳的提取条件为：甘油浓度为52.55%，pH为4.05，剪切转速为16 387.88 rpm，剪切温度为44.22 ℃时，预测BRP提取量为19.28 mg/g。但考虑到实际操作的局限性，将提取条件调整为：甘油浓度为53%、pH为4、剪切转速为16 200 rpm、剪切温度为44 ℃。根据此条件进行验证性实验，得到BRP的提取量为19.02±0.33 mg/g，与预测值19.28 mg/g的相对误差为1.35%，表明此响应面法得到的回归模型具有较好的可靠性。

3.3 BRP抗氧化活性

3.3.1 BRP对ABTS自由基的清除能力

如表4所示，BRP对ABTS 自由基有较强的清除作用，随着BRP质量浓度的增加，BRP对ABTS自由基的清除率逐渐增强，在0.2 mg/mL时，其ABTS自由基清除率时可达到94.39%。BRP和Vc 对 ABTS自由基清除作用的IC50值(指清除率为50%时，所需要样品的有效质量浓度)分别为0.013和0.016 mg/mL，表明白及须根多酚的ABTS自由基清除能力与Vc相当。

表4 BRP对ABTS自由基的清除作用

3.3.2 BRP对DPPH自由基的清除能力

如表5所示，BRP对 DPPH 自由基具有较好的清除作用，在0.012 5～0.2 mg/mL浓度内，BRP对DPPH自由基的抑制率分别为28.88%、30.62%、51.58%、72.35%、88.86%，即随BRP质量浓度的增加，DPPH 自由基清除率随之增强。BRP和Vc的DPPH自由基清除作用的IC50值分别为0.064、0.052 mg/mL。结果表明，白及须根多酚对DPPH自由基清除能力的变化规律与对ABTS自由基清除能力的变化规律一致，说明白及须根的抗氧化能力主要来自于多酚类物质。

表5 BRP对DPPH自由基的清除作用

3.3.3 BRP的还原能力

测定白及须根多酚对Fe3+的还原力，实际上是对样品的供电子能力进行检验，吸光值越大，表明还原能力越强。如表6所示，BRP 具有较好的还原能力，在0.012 5～0.2 mg/mL内，BRP 的还原能力与浓度有明显的依赖性。BRP和Vc的IC50值(指OD值达到0.5时，所需要样品的有效质量浓度)分别为0.166、0.043 mg/mL。

表6 BRP的还原能力

3.4 BRP对酪氨酸酶的抑制活性

如表 7 所示，BRP 对酪氨酸酶具有显著的抑制活性，在0.012 5～0.200 0 mg/mL浓度内，BRP对酪氨酸酶的抑制率分别为2.44%、14.52%、32.05%、49.63%、70.82%。BRP和Vc的酪氨酸酶抑制能力与其质量浓度呈显著正相关：BRP质量浓度(X)与酪氨酸酶抑制能力(Y)间的回归方程为Y=343.65X+ 7.2583，阳性对照Vc质量浓度(X)与酪氨酸酶抑制能力(Y)间的回归方程为Y=151.16X+6.616 3。BRP和Vc的酪氨酸酶抑制作用IC50值分别为0.124、0.287 mg/mL。由此可见，白及须根多酚的酪氨酸酶抑制活性优于阳性对照Vc。研究显示[20]，多酚类物质能够有效抑制酪氨酸酶活性，具有良好的美白作用效果。

表7 BRP对酪氨酸酶的抑制作用

4 结论

采用绿色溶剂甘油联合高剪切分散乳化技术提取白及须根多酚，并通过响应面分析法优化BRP提取工艺，得到最佳工艺条件为：甘油浓度为53%、pH为4、剪切转速为16 200 rpm、剪切温度为44 ℃，在此条件下预测提取量为19.28 mg/g，实际提取量为19.02 mg/g，理论值与实际值相符，结果可行。因此，白及须根多酚的提取制备可用此模型，该模型也为将来白及须根废弃物资源的开发与利用提供参考依据，具有一定的应用价值。

体外生物活性实验结果表明，BRP具有良好的ABTS、DPPH自由基清除能力和还原能力，其抗氧化活性与浓度呈显著正相关。BRP能显著抑制酪氨酸酶活性，且抑制效果优于阳性对照Vc。本研究结果揭示了多酚类物质是白及须根发挥抗氧化、酪氨酸酶抑制作用的物质基础，表明白及须根多酚在深度开发成美白功能性化妆品领域具有较好的潜力。