三种七叶一枝花活性成分抗新型冠状病毒的分子对接预测

司 渊，王 纠，张 亮，刘雪文，刘 莹,,4*

1湖北医药学院 基础医学院；2湖北医药学院 胚胎干细胞湖北省重点实验室；3湖北医药学院 武当特色中药研究湖北省重点实验室；4湖北医药学院 生物医药研究院，十堰 442000

2019年12月，新型冠状病毒SARS-CoV-2在湖北省武汉市迅速爆发[1]。截至2020年6月22日，我国共有85 018例新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)确诊病例，其中死亡患者4 646例。其后，美国、意大利、西班牙、英国、法国、德国、伊朗、瑞士、韩国、日本等全球200多个国家也报道了超过897万例感染病例。感染SARS-CoV-2的患者的常见症状是发烧，咳嗽和肌痛或疲劳[2,3]。SARS-CoV-2的S蛋白和SARS-CoV的S蛋白结构相似，并且均对人细胞表面的血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)具有显著的结合亲和力，通过ACE2的介导进入人体。ACE2在肺，消化道，肾脏等组织细胞中广泛表达，目前认为是SARS-CoV-2进入宿主细胞的关键[4,5]。临床治疗表明，传统中药结合西药对COVID-19具有显著的治疗效果[6]。到目前为止，对COVID-19的治疗还缺乏特效药。因此，迫切需要找到有效的抗病毒药物来遏制这种疾病。

百合科重楼属植物七叶一枝花(Parispolyphylla)又名蚤休、草河车、白甘遂，其根茎称为重楼。重楼作为中草药药用历史悠久[7,8]，有抗炎、止血、杀菌、镇静、止痛、平喘、止咳的作用，民间还用于治疗各种疮毒、痈疽、毒蛇咬伤等[9,10]。20世纪70年代以来，关于重楼中的活性成分的研究一直在继续。目前，已在重楼中发现了上百种化学成分，其中有70多种为甾体皂苷类化合物。而重楼中含量较多的甾体皂苷类化合物异包括螺甾烷醇类的薯蓣皂苷和偏诺皂苷。重楼皂苷I(polyphyllin I)、重楼皂苷VI(polyphyllin VI)和重楼皂苷VII(polyphyllin VII)均属于薯蓣皂苷(图1)，在重楼中含量丰富，广泛用于多种疾病治疗研究，包括抗肿瘤，免疫调节，抑菌作用等。重楼皂苷为螺旋甾烷类皂苷；皂苷由苷元与糖、糖醛酸或其他有机酸组成。其结构上包含一个共有的母核(图1)，母核由六个环，27个碳原子组成，其中A、B、C、D为甾体母核(环戊烷多氢菲)。甾体母核连接一个呋喃环E和一个吡喃环F。并多以螺缩酮形式相连。

图1 重楼中三种活性成分及其母核结构式

有研究报道重楼对亚洲A型流感病毒有抑制作用[11]。但目前国内外对研究仍主要集中于其抗肿瘤及免疫调节作用[12]，较少见其抗病毒方面的作用。为了研究重楼是否具有抗SARS-CoV-2的潜在作用，我们对3种主要重楼皂苷进行分子对接模拟，预测其结合ACE2的能力。通过结合自由能评估3种化合物与ACE2之间的相互作用，为COVID-19的药物发现提供研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料

三种化合物结构见图1。SARS-CoV-S/ACE2复合蛋白的三维结构在蛋白质数据库(Protein Data Bank)中PDB的编号为6ACG。

1.2 方法

分子对接：所有的对接实验运用Autodock 4.2程序。在AutoDock 4.2计算程序中，采用0.375间隔的70×70×70点阵模块。使用Lamarckian遗传算法进行对接计算，算法如下：150的群体，最大值2 500万次能源评估，最高次数2 000，交叉率0.8，突变率0.02，独立对接运行50次。使用公差为2的均方根偏差将对接构象聚类，并根据结合自由能评估最终对接结构。

2 结果

2.1 重楼皂苷I与SARS-CoV-2受体ACE2存在结合作用

分子对接结果表明，重楼皂苷I可能与ACE2酶具有最高的结合活性，结合自由能为-9.01 kcal/mol，潜在的结合位点包括Phe-40、Arg-273、Phe-274、Pro-346、Thr-347、Ala-348、Asp-350、Phe-390、Arg-393、Asn-394、His-401、Glu-402、Glu-406、Tyr-515、Arg-518等氨基酸残基。重楼皂苷I的氢原子能够与Glu-406上的氧原子形成氢键，氢键键长为2.2Å(图2)。

图2 重楼皂苷I结合SARS-CoV-2受体ACE2的分子对接结果

2.2 重楼皂苷VI与SARS-CoV-2受体ACE2存在结合作用

重楼皂苷VI结合ACE2的自由能是-8.52 kcal/mol，潜在的结合位点包括Leu-73、Ala-99、Gln-102、Pro-346、Thr-347、Ala-348、Asp-350、Glu-375、His-378、Asp-382、Tyr-385、Asn-394、Gly-395、Asn-397、Glu-398、His-401、Glu-402、Arg-514等氨基酸残基。重楼皂苷VI的氢原子能够与Tyr-385氨基酸上的氧原子形成氢键，氢键键长为2.1Å和2.2Å；配体上的氢原子与Glu-402上的氧原子形成氢键，键长为2.0Å(图3)。

图3 重楼皂苷VI结合SARS-CoV-2受体ACE2的分子对接结果

2.3 重楼皂苷VII与SARS-CoV-2受体ACE2存在结合作用

重楼皂苷VII结合ACE2的自由能是-8.21 kcal/mol，潜在的结合位点包括Phe-40、Ser-44、Trp-69、Leu-73、Pro-346、Thr-347、Ala-348、Trp-349、Asp-350、Glu-375、His-378、Phe-390、Asn-394、His-401、Glu-402、Glu-406、Tyr-515等氨基酸残基。重楼皂苷VII的氢原子能够与Ser-44上的氧原子形成氢键，氢键键长为2.0Å(图4)。

图4 重楼皂苷VII结合SARS-CoV-2受体ACE2的分子对接结果

3 讨论

以上对接结果表明，3个甾体皂苷和ACE2均存在较强的结合作用，而其中重楼皂苷 I和ACE2结合所需的能量最低。能量越低表明更易于结合ACE2。通过结合位点汇总分析，三种化合物共同结合ACE2蛋白的残基有7个，分别是Pro-346、Thr-347、Ala-348、Asp-350、Asn-394、His-401、和Glu-402(图5)。同时，从图中可以看出重楼皂苷I和重楼皂苷VI结合活性位点取向相同，但是由于空间位阻原因，重楼皂苷VI无法像重楼皂苷I呈直线排布。重楼皂苷I和重楼皂苷VII的空间位阻类似，但是取向相反。三种药物结合活性位点的结构主要是母核起着关键作用，与其相作用的氨基酸位点大部分以疏水作用氨基酸(His、Ala、Pro)为主，其次是起到氢键作用的氨基酸。含有羟基的氨基酸(Glu、Thr、Asp等)可以更好的容纳糖环。

图5 三种重楼皂苷结合SARS-CoV-2受体ACE2的分子对接总图及共同结合的氨基酸残基位点

由于SARS-CoV-2是一种新发现的病毒，目前还没有确定或可用的特效药物。而经济有效的治疗策略是利用现有药物。临床治疗表明，中药结合西药对COVID-19具有显著的治疗效果[6]。因而筛选从中草药中提取的现有药物不失是一项有效策略。已有研究发现氯喹(chloroquine)在体外控制SARS-CoV-2感染方面非常有效。氯喹是一种4-氨基喹啉，除了主要作为抗疟药物，还能够通过减少ACE2受体的末端糖基化，干扰SARS-CoV-2与ACE2受体结合来发挥抑制病毒复制的作用[13]。Cheng等[14]使用分子对接来计算氯喹与ACE2结合能。结果发现氯喹具有与ACE2的潜在结合能力，结合自由能为-5.70 kcal/mol，结合位点为Leu-95、Gln-58、Gln-102。与氯喹相比，三种重楼皂苷与ACE2的对接结合自由能更低。近期，随着SARS-CoV-2感染的全球化扩散，越来越多的研究者投入到抗SARS-CoV-2药物的筛选中。Yan等[15]通过分子对接对38种中国专利药物进行针对ACE(PDB:1R4L)及病毒主要M蛋白酶(PDB: 6LU7)的对接筛选，发现了包括青蒿素、芦丁、甘草甜素、葛根素、穿心莲内酯、苦参碱等10种潜在抗SARS-CoV-2药物。Liu等[16]基于网络药理学和分子对接研究发现木犀草素(-26.78 kJ/mol)、槲皮素(-26.36 kJ/mol)、去甲脱水淫羊藿黄素(-25.94 kJ/mol)与SARS-CoV-2 3CL水解酶存在结合作用。可能有些药物与ACE2对接活性较低，但这并不意味着它们不适用COVID-19治疗，因为对接模拟仅是提供一个前期研究的参考。此外，制定中药处方的原则包括消除病原入侵和增强机体抵抗力。因此，我们不能排除有些药物通过调节免疫系统对COVID-19起作用。有必要进行进一步的实验，以验证这些甾体皂苷类化合物是否可以靶向ACE2并预防细胞培养模型和实验动物中SARS-CoV-2的感染。