霍山石斛和铁皮石斛干花成分含量和抗氧化性的比较

张珍林，闵运江，黄仁术，刘莉彬，陈乃富*

1皖西学院生物与制药工程学院；2植物细胞工程安徽省工程技术研究中心；3安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，六安 237012

石斛是一种多年生草本中药，其中安徽霍山是兰科植物石斛属产地之一，位于大别山区北方[1]。安徽霍山产石斛种类虽多，但主要以霍山石斛和铁皮石斛两种为主产，每年4～5月份或10月份是霍山石斛的花期，5～7月份或10～11月份是铁皮石斛的花期，两种石斛花期均较短暂。

目前研究并开发石斛的药、食、赏价值已经很成熟，但花作为石斛的一大亮点，在研究、开发利用上并没有得到很好的发展。近几年关于石斛花的文献报道，总结有以下几个方面，研究石斛花的物质成分及抗氧化性，如：Miao等[2]关于超声-醋酸法提取铁皮石斛花总黄酮及其体外抗氧化性的研究报道；Zhang[3]、Liang[4]等关于石斛花多糖、黄酮以及药理学研究报道；研究加工条件对石斛花品质的影响，如：Zhang等[5]关于石斛花鼓风干燥机理和感官品质变化规律的研究报道；研究石斛花的挥发性成分，如：Lyu等[6]对11个铁皮石斛杂交系鲜花的挥发性成分分析，Qu等[7]关于四种石斛花氨基酸和挥发性成分比较研究。可见，对石斛花的基础研究存在一些，但并不全面，而从上述文献了解，石斛花是具备成为新型食品功能因子来源的潜力，伴随着人们对抗氧化性物质与健康的关系认识的发展，对石斛花进行深加工产品的研究值得关注。

所以，结合前期对石斛干花干制条件的摸索和研究[5]，依托霍山石斛花干制技术规程的制定，本研究进行了霍山产两种主要石斛花的营养成分、活性成分以及抗氧化性的分析比较。本试验以霍山主产的霍山石斛干花和铁皮石斛干花为原料，根据测定营养成分(蛋白质、氨基酸、维生素C、脂肪、总酸、多糖)、次生代谢物(多酚、黄酮、单宁)、两种石斛干花醇提液的抗氧化性进行分析研究。为充实石斛干花的深加工产品，建立完善石斛干花营养品质评价体系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料

实验材料为2018年5月初开始，分批次采自安徽省霍山县国家基本药物所霍山石斛原种基地，鲜花均来自根系生长3年的石斛，霍山石斛鲜花5月初(每日清晨)采收，铁皮石斛鲜花6月初(每日清晨)采收，去杂，摊晾，远红外鼓风干制，-20 ℃保藏，每次按统计学概率取样。经笔者陈乃富教授鉴定分别为霍山石斛DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng、铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的花。

1.1.2 仪器

数控超声波清洗器(KQ300DE型昆山市超声仪器有限公司)；电子天平((FA1204B上海越平科技有限公司)；高速万能粉碎机(FW100型津市泰斯特仪器有限公司)；紫外可见分光光度计(UV2100型尤尼柯上海仪器有限公司)；旋转蒸发仪(天津市纽森科技有限公司)；氨基酸自动分析仪(L8900型日本日立公司)。

1.2 方法

1.2.1 石斛干花营养成分分析方法

蛋白质含量测定，采用凯氏定氮法；维生素C含量测定，采用2,6～二氯靛酚滴定法；总酸含量测定，采用pH电位法；粗脂肪含量测定，采用索氏抽提法；粗多糖含量测定，采用硫酸-苯酚法。

1.2.2 石斛干花活性成分分析方法

总多酚含量测定，采用酒石酸亚铁比色法。

单宁含量测定，参照Zhao等[8]的方法并稍作修改；分别准确称取5.000 g干花粉，用80 mL水洗入100 mL容量瓶中，放入沸水浴中提取30 min，取出、冷却、定容，吸取2.0 mL样品提取液，离心4 min(8 000 rpm)，上清液备用。

总黄酮含量测定，参照Chang等[9]的方法并稍作修改；分别准确称取5.000 g石斛干花粉末于滤纸包中放入蒸馏瓶中，加入相应浓度的乙醇溶液，开始热回流提取，平行提取三次，将每次的收集液置于250 mL容量瓶中，最后用乙醇溶液定容至刻度，离心取上层清液备用。

1.2.3 石斛干花氨基酸含量测定与评价

氨基酸含量测定，参照Liu等[10]的方法并稍作修改；分别准确称取5.000 g两种石斛干花粉，加入5 mL 4%磺基水杨酸超声30 min，离心30 min(12 000 rpm)，取上清液备用；联合L8900日立氨基酸自动分析仪对试样中的17种氨基酸成分进行分析测定。

根据测定的氨基酸含量进行该样品的评价分析，参照Wei等[11]的计算方法；根据测定的氨基酸含量分别进行氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)、必须氨基酸指数(EAAI)分析。

1.2.4 石斛干花抗氧化性测定方法

DPPH自由基清除能力测定参照Sarker等[12]的方法并稍作修改。分别准确称取5.000 g已过260目筛的两种石斛干花粉置于装有40 mL浓度70%的乙醇溶液的圆底烧瓶中，热回流提取2 h，提取3次，每次所得提取液于250 mL容量瓶中，再用70%乙醇定容至刻度线，摇匀备用，以无水乙醇为空白，于517 nm处测定吸光度，同时以VC标准品作为对照，随后进行DPPH自由基清除能力的测试。清除率计算公式：清除率=[1-(A2-A1)/A0]×100%。

式中：A0：DPPH溶液和乙醇的吸光值；A1：乙醇与各浓度待测液的吸光值；A2：DPPH与各浓度待测液的吸光值。

铁氰化钾还原力测定参照Choochote等[13]的方法并稍作修改，获取提取液方法同上，,以水为空白，VC为阳性对照，于700 nm测定吸光度，随后进行铁氰化钾还原力测试。

1.2.5 数据分析

所有数据均采用SPSS17.0软件进行统计学分析，所有实验均重复测定3次；通过单因素方差分析(one-way ANOVA)对平均值、标准差及化学组分和抗氧化性间的相关性进行显著性比较，P<0.05表明具有差异，处理结果有显著差异出现，组间的平均值显著性再进行Duncan多重比较；每组数据均使用平均数±相对平均标准差表示。

2 结果与分析

2.1 石斛干花营养成分含量和活性成分含量

安徽霍山产霍山石斛干花和铁皮石斛干花的营养成分含量和活性成分含量结果见表1。通过表1可得到，霍山石斛干花的维生素C、粗多糖、粗蛋白、单宁、总酸的含量均高于铁皮石斛干花，而粗脂肪含量略低于铁皮石斛干花。从营养性角度来看，霍山石斛干花比铁皮石斛干花更适合作为人补充维生素C和蛋白质的良好来源。从功能性角度来看，霍山石斛干花在多酚、黄酮、单宁含量上均高于铁皮石斛干花，且霍山石斛干花中单宁的含量比铁皮石斛干花高33.6%，预测霍山石斛干花的抗氧化功效高于铁皮石斛干花。霍山石斛干花除粗脂肪和粗多糖含量与铁皮石斛干花无差异(P>0.05)，其余成分两种石斛干花均是差异显著(P<0.05)。

2.2 石斛干花氨基酸组成成分分析

2.2.1 石斛干花氨基酸组成成分

霍山产两种石斛干花的氨基酸测定结果统计见表2，两种石斛干花中常见氨基酸种类全面，均检测出17种氨基酸，两者氨基酸含量相比，霍山石斛干花略高于铁皮石斛干花，其中，两种花中酪氨酸含量都为最高。根据FAO/WHO的理想模式，质量较好的蛋白质其 EAA/TAA为0.40左右，EAA/NEAA在0.60以上，由此可见，霍山石斛干花比铁皮石斛干花更符合FAO/WHO的理想模式，表明其氨基酸营养价值高于铁皮石斛干花。

表2 石斛干花的氨基酸含量

2.2.2 石斛干花氨基酸组成成分分析

根据表2霍山石斛干花和铁皮石斛干花氨基酸含量结果，知道霍山产两种石斛干花均含有人体必需氨基酸，依据WHO提议的必需氨基酸成人摄取模式与鸡蛋氨基酸摄食模式，计算两种石斛干花的AAS、CS、EAAI值，进一步分析两种石斛干花营养品质，计算所得数据统计于表3。统计两石斛干花必需氨基酸含量评分总数分别为171.42 mg/g N、192.75 mg/g N，由此得出，两种石斛干花必需氨基酸评分总量均大于FAO/WHO标准的35 mg/g N和鸡蛋蛋白质标准的49.7 mg/g N。两石斛干花的氨基酸评分(AAS)和化学评分(CS)比值均大于100，这表明石斛干花中必需氨基酸模式极佳，人体在摄食时消化吸收和利用没有障碍。两种石斛干花中的EAAI值均在100以上，均是大于FAO/WHO评分模式中同种氨基酸含量。

表3 石斛干花的AAS、CS、EAAI比较

2.3 石斛干花抗氧化活性

2.3.1 石斛干花提取液对DPPH自由基清除能力

两种石斛干花提取液和对照品Vc对DPPH自由基清除能力如图1所示，由图可知，霍山石斛干花和铁皮石斛干花提取液均具有对DPPH自由基清除能力，且清除效果和溶液浓度相关。在0.1～1.0 mg/mL之间随着浓度的增加，对DPPH自由基清除能力逐渐增强。其中，计算得出霍山石斛干花提取物抗氧化的半数抑制浓度(IC50)为0.528 mg/mL，铁皮石斛干花提取物抗氧化的半数抑制浓度(IC50)为0.604 mg/mL。

图1 不同种类的石斛干花提取液自由基清除率效果

2.3.2 石斛干花提取液对铁氰化钾还原能力

通过铁氰化钾法测定两种石斛干花提取液和对照品Vc的还原能力，测得数据结果如图2。据图2看出，霍山石斛干花和铁皮石斛干花均具有对铁氰化钾的还原能力，且还原能力和浓度相关，在0.04～0.24 mg/mL的质量浓度之间对铁氰化钾还原力亦是随浓度的增加而加大，且霍山石斛干花和铁皮石斛干花都表现出还原力线性关系良好，霍山石斛干花提取液对铁氰化钾的还原力高于铁皮石斛干花，但还原力均比对照品Vc弱。

图2 不同品种的石斛干花提取液还原能力效果

2.4 石斛干花成分含量与抗氧化能力的相关性分析

2.4.1 霍山石斛干花成分含量与抗氧化能力的相关性分析

对霍山石斛干花所有测定成分和抗氧化性的相关性分析见表4。查相关系数临界值表，当α=0.05时，r=0.606；当α=0.01时，r=0.776得出，单宁与粗多糖正相关，多酚与粗多糖、单宁正相关，黄酮与粗蛋白、维生素C、单宁、多酚正相关，DPPH自由基清除率IC50与粗多糖、单宁、多酚、黄酮、氨基酸正相关，铁氰化钾还原能力与粗多糖、单宁、多酚、黄酮正相关。

表4 霍山石斛干花成分相关性分析

2.4.2 铁皮石斛干花成分含量与抗氧化能力的相关性分析

对铁皮石斛干花所有测定成分的相关性分析见表5。查相关系数临界值表，同上得出，单宁与粗多糖正相关，多酚与粗蛋白、粗多糖、单宁正相关，黄酮与维生素C、单宁、多酚正相关，氨基酸与单宁正相关，DPPH自由基清除率IC50与粗多糖、单宁、多酚、黄酮正相关，铁氰化钾还原能力与粗多糖、单宁、多酚、黄酮正相关。

表5 铁皮石斛干花成分相关性分析

3 讨论

前人的研究发现，涉及石斛及石斛花的研究主要集中在单一石斛品种，如Xin等[14]对铁皮石斛不同花期及花朵不同部位活性组分分析，只探讨了不同花期铁皮石斛花及盛花期花朵不同部位多糖、总黄酮及总酚质量分数的差异；多个石斛品种单一物质或多个石斛品种仅几个部分物质成分方面，如Zhang等[15]对石斛样品中几种营养成分的分析研究，也只是对粗灰分、全氮、全磷、钙和镁等5种营养成分分析。有关安徽霍山产石斛花整体物质成分的研究鲜有报道，本次研究对霍山石斛干花和铁皮石斛干花的粗蛋白、粗脂肪、粗多糖、维生素C、总酸、单宁、多酚、黄酮含量进行测定，发现霍山石斛干花中的粗蛋白、维生素C、单宁、总酸、多酚、黄酮与铁皮石斛干花相比明显高，且霍山石斛干花中必需氨基酸含量高于铁皮石斛干花，这一研究结果是首次提出。

前人的研究发现，果蔬、花卉等由于多酚氧化酶的存会导致在加工过程中产品颜色变深，如Jiu等[16]研究热激结合水杨酸处理对蝴蝶兰组培褐变的影响，发现多酚氧化酶对蝴蝶兰组培褐变影响很大。也有前人研究乌鸡的黑色素存在和酪氨酸有很大关系，如Li等[17]对日粮酪氨酸水平对0～4周龄泰和乌骨鸡生产性能及组织黑色素含量的影响研究。还有前人研究发现酪氨酸酶的存在是生物体中唯一参与黑色素合成的关键酶，Yan等[18]从美花石斛的茎中分离得到了12个化合物，其中有3个表现出良好的护肤活性，表达出酪氨酸酶抑制剂在美花石斛提取物中可以抑制酪氨酸酶活性。本研究在氨基酸测定时发现在两种干花中酪氨酸含量都为最高，酪氨酸是一种多酚衍生物，可以被酪氨酸单酚酶催化，由此推断石斛花干制后颜色会变深跟酪氨酸含量高有很大关系，对加工干制石斛花时进行颜色品质控制提供理论依据。

前人的研究结果表明，石斛花的抗氧化能力与总黄酮/芦丁的含量、多糖含量成正相关[2-4]。本研究在进行石斛干花成分含量与抗氧化能力的相关性分析时得出，霍山石斛干花和铁皮石斛干花在显著水平为0.05%时，抗氧化性能与多酚含量、黄酮含量、多糖含量、单宁含量、氨基酸含量均成正相关。前人在紫薯的研究中发现，不能单独利用花青素质量分数解释抗氧化能力的强弱，而是由多种生物活性物质综合决定[19]。本研究发现两种石斛干花主要营养成分之间多是相互独立的，在含量上没有表现出显著的相关性，说明它们之间不存在潜在的关联机制；但两种石斛干花主要次生代谢产物之间表现出极大正相关性，单宁含量、多酚含量、黄酮含量与主要营养成分之间都有一定关系，且单宁含量、多酚含量、黄酮含量相互也均呈现正相关，表明在植物生长过程中主要营养成分对次生产物含量是有影响，因此全面准确地分析霍山石斛干花和铁皮石斛干花提取液的抗氧化性对指导产品开发利用具有重要价值。

4 结论

霍山产霍山石斛干花和铁皮石斛干花均具有均衡的营养成分和活性成分，但霍山石斛干花中的粗蛋白、维生素C、单宁、总酸、多酚、黄酮含量明显较高，且霍山石斛干花中必需氨基酸含量高于铁皮石斛干花，对DPPH自由基清除效果及铁氰化钾的还原能力也是霍山石斛干花表现出强抗氧化能力。鉴于霍山石斛干花具有丰富的营养成分、活性成分及较强的抗氧化活性，可以作为石斛花新品和天然抗氧化剂资源进行开发利用，成为补充人体所需营养来源的一种理想原料。