谷氨酰胺对呕吐毒素诱导IPEC-J2细胞凋亡和炎症的影响

李若楠,康瑞芬,沈丹,戴鹏远,唐倩,李春梅

(南京农业大学动物科技学院,江苏 南京 210095)

呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),是由镰刀菌侵染农作物产生的一种B族单端孢霉烯族霉菌毒素,广泛存在于农作物中,严重威胁动物和人类的健康[1]。全球范围内,呕吐毒素的平均检出率高达59%,欧洲和亚洲的检出率最高[2]。龚阿琼等[3]对2017年我国多个地区的饲料原料进行了检测,经统计分析发现DON在大多数饲料原料中检出率均为100%。DON广泛存在于饲料和人类食品中,对人和动物的健康造成危害。DON可引起动物呕吐、拒食、腹泻、生长迟缓、肠道出血、免疫系统紊乱和神经系统疾病[4]。肠道作为营养物质消化和吸收的主要场所,亦是抵抗外源毒素和致病性病原微生物入侵的天然屏障[5]。肠道黏膜上皮是DON主要的靶器官,经口摄入的DON通过被动扩散进入肠上皮细胞后,抑制肠上皮细胞的蛋白质合成,破坏紧密连接蛋白的结构,损伤肠道屏障的完整性,增加肠上皮的通透性,降低营养物质的吸收和转运效率[6]。另外,也有研究报道,DON影响细胞增殖,诱导细胞发生程序性死亡,改变相关基因的表达[7]。本课题组前期研究发现,DON可诱发IPEC-J2细胞产生过量的ROS,降低细胞的存活率,诱导细胞凋亡和炎症相关基因及蛋白表达水平发生改变[8]。

谷氨酰胺(glutamine,Gln)作为一种功能性氨基酸,可以促进肠道黏膜再生,增强肠黏膜免疫力,减少氧化损伤,刺激肠上皮细胞增殖,增强肠屏障功能,维持小肠消化功能和黏膜完整[9]。在调节基因表达、细胞信号、抗氧化反应、神经传递和免疫等方面发挥着重要作用[10]。已有研究指出,仔猪饲料中添加Gln有利于维持仔猪小肠的完整性,促进小肠黏膜屏障的再生[11],但有关Gln是否能缓解毒素造成的肠道损伤尚未见报道。因此,本试验以IPEC-J2细胞为模型,探讨Gln对DON诱导的IPEC-J2细胞凋亡和炎症反应的影响,旨在阐明Gln在调节DON诱导的肠上皮细胞凋亡和炎症反应中可能发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

猪空肠上皮细胞(intestinal porcine epithelial cells,IPEC-J2)购自北京北纳创联生物有限公司;呕吐毒素购自美国Sigma公司;胎牛血清(FBS)、抗生素-抗真菌剂、DMEM高糖培养基均购自Gibco公司;荧光定量PCR(qPCR)试剂盒、反转录试剂盒购自TaKaRa公司;L-谷氨酰胺(纯度>99.0%)、活性氧自由基(ROS)水平检测试剂盒、MTT检测试剂盒及Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;cleaved-Caspase3抗体、NF-κB(P65)抗体购自美国Abcam公司。

1.2 细胞的复苏与培养

将冻存在液氮的细胞取出,于37 ℃水浴锅解冻,转移至15 mL离心管,1 000 r·min-1离心5 min;弃上清液后,加入4 mL DMEM高糖培养基(含10% FBS),重悬并混匀细胞沉淀,接种至细胞培养瓶,放入37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中培养。显微镜下观察细胞生长状况,视实际情况更换细胞培养液,待细胞融合达到80%时进行传代。弃上清液,PBS清洗3次后,加入1 mL胰酶并消化1.5 min,加入1 mL培养基终止消化;将贴壁的细胞轻轻吹打下来后,将传代细胞与培养基一起移入新的15 mL离心管中,1 000 r·min-1离心5 min;弃上清液后,加入完全培养基,重悬混匀后,接种至细胞培养瓶,放入细胞培养箱培养,用于试验处理或继续传代。

1.3 细胞活力测定

采用MTT方法测定细胞活力。IPEC-J2细胞以1×105mL-1细胞浓度接种到96孔板。当96孔板内的细胞融合度达到80%时,分别用相同体积的DMEM(CK)、Gln(0.25、0.75和1.25 mmol·L-1)、DON(2.0 μg·mL-1)、DON+Gln(2.0 μg·mL-1+0.25 mmol·L-1、2.0 μg·mL-1+0.75 mmol·L-1、2.0 μg·mL-1+1.25 mmol·L-1)处理细胞24 h,参照MTT检测试剂盒说明书检测细胞活力。

1.4 试验设计与处理

以IPEC-J2细胞为模型,试验分为4个组,分别为细胞对照组(CK)、Gln组(0.75 mmol·L-1Gln)、DON组(2.0 μg·mL-1DON)、DON+Gln组(2.0 μg·mL-1DON+0.75 mmol·L-1Gln)。DON溶于无水乙醇并配制成1 mg·mL-1的储存液于-20 ℃保存,用基础培养基稀释至2.0 μg·mL-1并于4 ℃保存。L-谷氨酰胺(纯度>99.0%)用培养基配制成10 mmol·L-1的储存液于4 ℃保存。将消化后的细胞以均等浓度分别接种到96孔板或6孔板,当细胞融合度达到80%时,Gln、DON和DON+Gln组分别用含有DON或(和)Gln的DMEM高糖培养基替代DMEM高糖培养基,继续培养(4、8和24 h)进行相关试验。

1.5 细胞ROS水平测定

将盖玻片消毒后放入12孔板中,将100 μL细胞悬液按105mL-1的密度接种于12孔板,4～6 h后显微镜下观察细胞是否贴壁,贴壁后每孔加1 mL完全培养基。细胞融合度达到80%时,弃掉培养液,用相同体积的DMEM(CK)、Gln(0.75 mmol·L-1)、DON(2.0 μg·mL-1)、DON+Gln(2.0 μg·mL-1DON+0.75 mmol·L-1Gln)处理细胞24 h后,参照ROS检测试剂盒说明书检测ROS水平。操作结束后用激光共聚焦显微镜观察爬片并拍照。

1.6 细胞凋亡率测定

IPEC-J2细胞以2×105mL-1浓度接入6孔板,当细胞融合度达到80%时,用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶进行消化,参照Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒说明书,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 细胞凋亡和炎症相关基因表达水平的测定

细胞以2×105mL-1浓度接入6孔板,当细胞融合度达到80%时,提取细胞RNA;测定细胞RNA浓度后,按照TaKaRa反转录试剂盒说明书对RNA进行反转录,获得cDNA;测得cDNA浓度后,将各样品cDNA浓度稀释到100 ng·μL-1,-20 ℃保存或用于后续试验。按照TaKaRa SYBR®PremixExTaq试剂盒说明书加入各反应试剂,在RT-qPCR仪上检测细胞凋亡和炎症相关基因的表达。设定反应程序如下:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40个循环;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCT法计算各基因相对表达水平。

表1 IPEC-J2细胞凋亡和炎症因子相关基因的引物序列Table 1 The sequences of genes of primers related apoptosis and inflammatory cytokines

1.8 细胞凋亡和炎症相关蛋白表达的测定

利用免疫荧光法测定细胞凋亡和炎症相关蛋白的表达情况。用相同体积的DMEM(CK)、Gln(DMEM+0.75 mmol·L-1Gln)、DON(DMEM+2.0 μg·mL-1DON)、DON+Gln(DMEM+2.0 μg·mL-1DON+0.75 mmol·L-1Gln)处理细胞24 h后,将培养基移除,每孔加入PBS(37 ℃预热)1 mL,放在摇床上清洗(3次,每次5 min);移除PBS,加4%多聚甲醛(1 mL),室温固定1 h;移除多聚甲醛,PBS摇床清洗后,加入100 μL TritonX-100(0.5%)通透10 min,PBS清洗;加入1 mL 1%牛血清白蛋白(BSA),室温封闭1 h;盖玻片上滴加50 μL一抗,37 ℃于湿盒中避光孵育1 h;PBS清洗后,滴加50 μL Alexa Fluor 488标记的二抗,于湿盒中37 ℃避光孵育1 h;移除二抗,PBS摇床清洗后滴加50 μL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),于湿盒中室温避光孵育10 min,PBS清洗;载玻片上滴加荧光抗淬灭剂,将细胞爬片倒扣在载玻片上封片。

1.9 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 Gln对DON诱导IPEC-J2细胞活力的影响

由图1可知:与对照组相比,0.75 mmol·L-1Gln组和1.25 mmol·L-1Gln组细胞的存活率显著升高(P<0.01),DON组(2.0 μg·mL-1)和DON+0.25 mmol·L-1Gln组细胞的存活率显著降低(P<0.01),而DON+0.75 mmol·L-1Gln组和DON+1.25 mmol·L-1Gln组细胞的存活率无显著差异。与DON组相比,DON+0.75 mmol·L-1Gln和DON+1.25 mmol·L-1Gln组细胞存活率显著上升(P<0.01)。DON+0.75 mmol·L-1Gln组细胞活力与对照组相近,因此,我们选取0.75 mmol·L-1Gln作为试验剂量。

2.2 Gln对DON诱导细胞ROS水平的影响

如图2所示:DON(2.0 μg·mL-1)处理IPEC-J2细胞24 h后,与对照组相比,DON组ROS的荧光值显著升高(P<0.01);而Gln(0.75 mmol·L-1)处理IPEC-J2细胞24 h后,其ROS的荧光值无显著变化。与DON组相比,DON+Gln组细胞ROS的荧光值显著降低(P<0.01)。

2.3 Gln对DON诱导细胞凋亡的影响

如图3所示:DON(2.0 μg·mL-1)处理IPEC-J2细胞24 h后,早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例显著增加(P<0.01);用Gln(0.75 mmol·L-1)单独处理细胞时,会显著降低早期凋亡细胞的比例(P<0.01);DON和Gln同时处理细胞时,与DON组相比,早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例显著性降低(P<0.01)。

2.4 Gln对DON诱导细胞凋亡和细胞炎症相关基因表达的影响

2.4.1 对细胞凋亡相关基因表达的影响由图4可知:DON(2.0 μg·mL-1)或Gln(0.75 mmol·L-1)处理IPEC-J2细胞4 h,与对照组相比,Gln组Caspase-3基因表达水平显著升高(P<0.05),DON+Gln组Caspase-3和Caspase-8基因表达水平显著升高(P<0.05);与DON组相比,DON+Gln组Caspase-3和Caspase-8基因的表达水平显著升高(P<0.05)。DON或Gln处理IPEC-J2细胞8 h,与对照组相比,Gln组Bcl-2基因的表达水平显著升高(P<0.05),DON+Gln组Caspase-8、BAK和Bcl-2基因的表达水平显著升高(P<0.05);与DON组相比,DON+Gln组Caspase-3基因的表达水平显著降低(P<0.05),BAK、Bcl-2、Caspase-8基因的表达水平显著升高(P<0.05)。24 h时,各基因表达水平在各处理组间无显著性差异。

2.4.2 对细胞炎症相关基因mRNA表达的影响由图5可知:DON(2.0 μg·mL-1)或Gln(0.75 mmol·L-1)处理IPEC-J2细胞4 h,与对照组相比,DON组IL-6、COX-2和TNF-αmRNA表达水平显著升高(P<0.01),DON+Gln组COX-2、IL-1β和TNF-αmRNA表达水平显著升高(P<0.01);与DON组相比,DON+Gln组的IL-1β和TNF-αmRNA表达水平显著升高(P<0.01),IL-6和COX-2mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。DON或Gln处理IPEC-J2细胞8 h,与对照组相比,Gln组IL-1βmRNA表达水平显著升高(P<0.01),DON+Gln组IL-6mRNA表达水平显著增加(P<0.01);与DON组相比,DON+Gln组的IL-6mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。24 h时,与对照组相比,Gln组IL-1βmRNA表达水平显著升高(P<0.01),DON+Gln组IL-6mRNA表达水平显著升高(P<0.01);与DON组相比,DON+Gln组IL-6mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。

2.5 Gln对DON诱导细胞凋亡和细胞炎症相关蛋白表达水平的影响

由图6可知:DON(2.0 μg·mL-1)处理IPEC-J2细胞24 h后,IPEC-J2细胞的cleaved-Caspase3蛋白在细胞质内大量表达。与对照组相比,Gln(0.75 mmol·L-1)组cleaved-Caspase3蛋白的荧光强度无显著变化,DON组cleaved-Caspase3蛋白的荧光强度极显著升高(P<0.01);与DON组比,DON+Gln组细胞的cleaved-Caspase3蛋白荧光强度有所降低但无统计学差异;NF-κB蛋白在细胞质内被观察到,且DON处理后其蛋白的荧光强度与对照组相比显著升高。与对照组相比,Gln组NF-κB蛋白的荧光强度无显著变化;与DON组相比,DON+Gln组细胞的NF-κB蛋白荧光强度减少但无显著差异;磷酸化NF-κB蛋白由细胞质转移至细胞核而大量表达。与对照组相比,Gln组和DON+Gln组细胞的磷酸化NF-κB蛋白荧光强度无显著变化,DON组蛋白的荧光强度显著增加(P<0.05)。与DON组相比,DON+Gln组细胞的磷酸化NF-κB蛋白荧光强度显著降低(P<0.05)。

3 讨论

氨基酸是生物体内重要的一类物质,参与机体中蛋白质的合成和各种生理活动。Gln作为哺乳动物体内的非必需氨基酸,可由体内其他氨基酸转化而来,其代谢后产生的ATP是葡萄糖的3倍,被认为是小肠的主要供能物质[12]。Gln具有抗氧化功能,可以促进谷胱甘肽过氧化物酶基因的表达,还可通过氧化供能调节信号传递过程中细胞凋亡酶的活性,抑制一氧化氮的合成速率,参与由TNF-α诱导的细胞毒性作用和抗氧化物质谷胱甘肽的合成[13]。ROS检测结果表明,添加Gln可以降低由DON引起的过量ROS,这可能是由于谷胱甘肽促进谷胱甘肽过氧化物酶的合成,从而提高细胞抗氧化能力,清除部分氧自由基,从而降低ROS水平。Evans等[14]研究发现,在HT-29结肠癌细胞中由TNF-α相关凋亡诱导配体(TRAIL)引起的细胞凋亡会提高细胞核的聚缩,激活Caspase-8和Caspase-3的表达;添加Gln可抑制由TRAIL引起的细胞凋亡,但其缓解由细胞因子升高引起的细胞凋亡机制与细胞GSH介导的抗氧化应激机制并不相同。本试验结果发现,添加Gln可降低由DON诱导的IPEC-J2 细胞凋亡相关蛋白cleaved-Caspase3的表达。因此,我们猜想Gln对肠上皮细胞的保护作用可能与凋亡相关蛋白表达的改变相关。

Gln作为供能物质,当机体经口或非经口途径摄入Gln后肠道的细胞因子水平会有所降低。在对人体进行肠道活检时发现,采用Gln治疗的病人肠道促炎细胞因子IL-6和IL-8基因表达量显著降低,这主要是因为Gln抑制了NF-κB的激活[15]。脑部创伤大鼠模型注射Gln后发现,Gln会缓解大鼠肠道组织形态损伤并降低肠道内细胞因子的表达量,其缓解作用可能是通过降低肠道内NF-κB蛋白的表达量来实现的[16]。谷氨酰胺对急性肺损伤小鼠具有保护作用[17]。本试验结果表明,Gln处理24 h可以降低IPEC-J2细胞促炎细胞因子IL-6和COX-2基因表达量,降低NF-κB和磷酸化NF-κB蛋白的表达量,提高细胞的抗炎能力,但在处理4 h和 8 h时,Gln促进炎症因子IL-6和IL-1β基因的表达。因此,我们推测Gln缓解细胞炎症反应与处理时间有关,短时间内炎症因子的释放可能是细胞受到外界刺激启动防御机制的一种表现,随处理时间的延长才显现出Gln的缓解作用,炎症相关因子的表达量开始呈降低趋势。

TNF-α是巨噬细胞被激活后产生的细胞因子,具有细胞毒性,其毒性作用会抑制Gln的蛋白质合成功能[18]。研究发现ROS通过诱导细胞TNF-α的增加,促进肾小球上皮细胞凋亡,而加入过氧化物清除剂后,凋亡比例降低[19]。本试验结果显示,虽然Gln可以清除ROS,但DON+Gln组TNF-α基因的表达量与DON组相比显著升高,这可能与Gln的处理时间、靶向性、特异性和不同抗氧化剂的过度补偿作用有关。在基因水平上,Gln促进IPEC-J2细胞内TNF-α基因的表达,进而促进Caspase-3及Caspase-8基因的表达。但蛋白表达结果表明Gln降低细胞凋亡和炎症相关蛋白的表达,因此,试验结果最终表现为细胞凋亡相关蛋白的表达量降低,细胞凋亡比例降低。

本研究结果表明,Gln通过清除IPEC-J2细胞中过量的ROS、调节凋亡和炎症相关基因及蛋白的表达水平来缓解由DON引起的肠道上皮细胞损伤,该结果为Gln在动物生产中的应用提供了基础理论依据。