山杏叶中角鲨烯提取工艺的研究

彭艳芳，段晓玮，徐岩岩，李 洁

（河北民族师范学院 生物与食品科学学院，河北 承德，067000）

角鲨烯（Squalene，C 30H 50，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)，是一种高度不饱和烃类化合物，最初是在黑鲨鱼Black shark肝油中发现，是一种重要的生物活性物质，具有增强免疫力、抗癌、防癌及保湿养颜作用，广泛应用于化妆品、医药、保健品、食品等行业[1]。目前提取角鲨烯，多以大鲨鱼Shark肝为原料，资源短缺。因此，寻找新的角鲨烯原料资源是提高角鲨烯产量、降低产品价格的必要途径。山杏Armeniaca sibirica是我国北方荒山绿化树种和经济树种，浑身是宝，山杏仁是生产杏仁露的原料，山杏壳可以加工成活性炭，山杏壳木醋液是绿色农用肥的主要原料；民间常以发酵山杏叶做饲料喂猪，猪生长快，不生病。研究发现，山杏叶中含有大量黄酮、三萜类生物活性物质[2]，张婷等[3]发现山杏叶40%乙醇提取物抗氧化活性最高。李洁等[4]在蛋鸡饲料中添加0.3%的山杏叶发酵物，可提高蛋鸡产蛋量，降低蛋壳破损率和料蛋比。我国山杏资源丰富，从山杏综合利用的角度出发，进一步研究山杏叶的成分及功能十分必要。

本研究以山杏叶为材料，采用SEF-CO2（CO2超临界萃取法）法提取山杏叶油，在GC-MS成分分析的基础上，对提取其中角鲨烯的溶剂、条件进行研究，以期建立最佳提取工艺，为山杏叶的深加工和综合利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 试验用山杏叶于2016年10月10日采自河北省承德市罗汉山，分别从4棵山杏树（树龄约20 a，胸径约10 cm） 的东西南北四个方向各采摘约200 g老叶，混合均匀。一部分叶片于鼓风干燥箱120℃杀青5 min，于70℃烘干至恒质量，然后用粉碎机粉碎，过100目筛，所得样品用于山杏叶油的制备；另一部分叶片放在通风良好的室内自然干燥至含水量约5%，粉碎，过20目筛，将处理好的样品放在干燥器中用于山杏叶角鲨烯提取工艺研究。

1.1.2 试剂 30～60℃沸程的石油醚、60～90℃沸程的石油醚、环己烷均为分析纯；角鲨烯标准品（购自成都普菲德生物技术有限公司)。

1.1.3 仪器与设备 TRACE MS 2000型气相色谱-质谱联用仪（美国Finnigan公司）。FA1204B电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；荣华HH-1数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；101-2A型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；安捷伦（Agilent）7820型气相色谱仪。

1.2 试验方法

1.2.1 山杏叶油的制备 山杏叶油的制备采用SEF-CO2法。称取10 g干燥好的山杏叶样品放入脱脂棉布小袋中，封好口；于40℃，27.58 MPa条件下提取2 h，提取结束后，将提取物收集在小玻璃瓶中封口，保存在4℃的冰箱中，以便进行GC-MS分析。

1.2.2 GC-MS条件 DB-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 um)。气化温度280℃；升温程序：初始温度80℃（1 min），以5℃·min-1升温速率升至150℃，再以3℃·min-1升温速率升至180℃，然后以7℃·min-1升温速率升至260℃，维持20 min；载气流量1.0 mL·min-1。EI电离源，离子源温度200℃；扫描质量范围m/z（质子数/电荷数的比值）40～610。

1.2.3 气相色谱条件 Agilent色谱柱HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 um）上分离，进样口温度为300℃，火焰离子化检测器（FID）温度300℃，柱温270℃，载气流速2 mL·min-1。

1.2.4 角鲨烯标液 精密称取角鲨烯标准品32.8 mg，用石油醚溶解，用10 mL容量瓶定容，浓度为3.28 mg·mL-1，将其稀释，依次得到0.328，0.164 mg·mL-1的标准溶液，经气相色谱仪检测，得到山杏叶角鲨烯标准品浓度与峰面积的标准曲线，浓度与峰面积应成线性关系。

1.2.5 单因素试验 以山杏叶角鲨烯的含量为考察指标，分别对提取时间、料液比、提取温度、提取溶剂4个影响提取率的因素进行考察，设定提取时间分别为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h；料液比分别为1:2，1:4，1:6，1:8，1:10（g·mL-1），提取温度分别为50，60，70，80，90℃，提取溶剂分别为60～90℃的石油醚，30～60℃的石油醚，环己烷，每组重复3次平行实验，取其平均值。固定的单因素条件为提取时间2 h、料液比1:4（g·mL-1）、提取温度60℃、提取溶剂60～90℃的石油醚。

1.2.6 正交试验设计 在单因素试验的基础上，以提取时间、料液比、提取温度3个因素建立3因素3水平的正交试验，以山杏叶角鲨烯含量为评价指标，进一步选取最佳工艺条件。正交试验因素与水平见表1。

表1 3因素3水平正交试验设计Table 1 Orthogonal test design of three factors and three levels

1.3 数据处理

采用Excel软件进行作图、数据分析。

2 结果与分析

2.1 山杏叶中角鲨烯的鉴定

采用SEF-CO2制备山杏叶油，用GC-MS进行成分分析（见图1、图2），从山杏叶中共检出79个色谱峰，鉴定出20个化合物，其中角鲨烯（38.49%）＞烷烃（9.36%）＞不饱和脂肪酸（9.1%）＞酯类（6.96%）＞植醇（3.71%），可见山杏叶油中以角鲨烯为主要成分，含量较高。

图1 山杏叶油总离子流色谱图( t=39.97)Figure 1 Total ion current chromatogram of oil from A.sibirica leaves

图2 质谱库中角鲨烯标准质谱图（A）与t=39.97色谱峰质谱图（B）的比较Figure 2 Comparison on mass spectrum of squalene between standard and t=39.97 chromatographic peak (Figure 1)

2.2 山杏叶角鲨烯提取单因素试验结果

2.2.1 最佳提取时间 由图3可知，提取液中山杏叶角鲨烯的含量随着提取时间的增加而呈上升趋势，这是由于随着提取时间的增加，山杏叶角鲨烯大量迁移出，在1.0～2.5 h山杏叶角鲨烯迁移速度较快，超过2.5 h后角鲨烯迁移速度放慢，说明山杏叶中大部分内角鲨烯在2.5 h左右就已迁移出，为了尽可能的多提取出山杏叶中的角鲨烯，因此确定最佳的提取时间为3.0 h。

2.2.2 最佳料液比 由图4可知，提取液中山杏叶角鲨烯的含量随着料液比的增加而增加，在料液比≥1:8时，山杏叶中角鲨烯的含量趋于稳定。分析其原因是由于当料液比较低时，固液体系间有效成分的浓度差随着料液比的提高而增大，更有利于传质。由此确定超声处理的最佳料液比为1:8。

图3 提取时间对山杏叶角鲨烯提取量的影响Figure 3 Effect of extraction duration on squalene yield

2.2.3 最佳提取温度 由图5可得出，当提取温度在50～60℃时，提取液中山杏叶角鲨烯的含量随着温度的升高而增加，这是因为在温度较低时，升温有利于山杏叶角鲨烯在石油醚中的溶解；提取温度在60～90℃时，提取液中山杏叶角鲨烯的含量随着温度的升高而减少，角鲨烯的沸点为285℃，对温度非常稳定，理论上，60～90℃升温同样应该有利于山杏叶角鲨烯的溶解移出，但提取液中山杏叶角鲨烯的含量反而减少，这可能是山杏叶中含有氧化物质，在提取过程中一部分角鲨烯被氧化消耗掉[5]，使得角鲨烯的含量减少。因此，确定超声提取温度为60℃。

2.2.4 最佳提取溶剂 根据图6得出，提取溶剂为石油醚60～90℃时，提取液中山杏叶角鲨烯的含量最高，其次为石油醚30～60℃，环己烷提取效果最差。高贵桃等[6]对甘草Glycyrrhiza uralensis综合利用中角鲨烯提取工艺的研究表明石油醚的提取效果好于正己烷（环己烷与正己烷性质类似）。另外考虑到石油醚30～60℃在室温下即可气化，对温度非常敏感，因此，确定最佳提取溶剂为石油醚60～90℃。

图4 料液比对山杏叶角鲨烯提取量的影响Figure 4 Effect of solid-liquid ratio on squalene yield

图5 提取温度对山杏叶角鲨烯提取量的影响Figure 5 Effect of extraction temperature on squalene yield

图6 提取溶剂对山杏叶角鲨烯提取量的影响Figure 6 Effect of extraction solvent on squalene yield

2.3 正交试验结果分析

以提取时间（A）、料液比（B）、提取温度（C）三个因素为自变量，经水浴冷凝后提取液中山杏叶角鲨烯含量为指标，进行正交试验，试验方案和结果如表2，从表2可见，各因素对提取液中山杏叶角鲨烯含量影响的大小次序为：C> B > A，即提取温度影响最大，料液比其次，提取时间影响最小。综合各因素的K值比较，计算得出山杏叶角鲨烯最佳提取工艺条件为C1B3A1，即提取温度为60℃、料液比为1:10、提取时间为2.5 h；而直接观看得到的最佳工艺条件为第6号试验，即C1B3A2。因素C，B直接观看与计算结果皆一致，因素A直接观看与计算结果不一致，直接观看因素A，第二水平最好，即3.0 h，而计算结果因素A采用第一水平时最好，即2.5 h。

表2 正交试验L9（33）及结果Table 2 Orthogonal test L9（33）and results

2.4 正交验证试验

由于直接观看得到的最佳工艺条件（C1B3A2）与计算所得出的最佳提取工艺条件（C1B3A1）不一致，因此需对上述两种提取工艺条件进行验证试验，每组试验重复3次。结果表明，直接观看的最佳工艺条件C1B3A2得到的山杏叶角鲨烯含量为2.11 mg·g-1，计算所得的最佳提取工艺条件C1B3A1得到的山杏叶角鲨烯含量为2.08 mg·g-1；F检验表明，两者之间不存在显著性差异。从极差R值来看，提取时间对提取液中山杏叶角鲨烯含量影响极小；再从生产上节约原材料、降低成本角度考虑，提取时间以2.5 h为好。

3 结论与讨论

经单因素试验和正交试验得到山杏叶角鲨烯最佳提取工艺条件：提取溶剂为石油醚60～90℃，提取温度为60℃，料液比为1:10，提取时间为2.5 h。由最佳提取工艺提取出的山杏叶中角鲨烯含量最高可达2.19 mg·g-1，折合百分率为0.219%。

目前，角鲨烯的主要生产原料是深海鲨鱼的肝脏，由于资源有限，致使其商品价格昂贵。寻找新的角鲨烯生产原料至关重要。有研究者报道一些植物油脂中含有角鲨烯，如省沽油Staphylea bumalda籽油中角鲨烯含量可达6.5%[7]，苋属Amaranthus植物的种子油中为4.9%[8]，橄榄Canarium album油中为0.7%[9]，而这些研究的材料均为植物种子油，需要先榨油再提取角鲨烯，工艺复杂、成本高。目前尚未有山杏叶提取角鲨烯的相关报道，以山杏秋天老叶为原料提取角鲨烯，一方面促进了山杏资源的综合利用，加长了山杏的产业链；另一方面也拓宽了角鲨烯生产的原料来源，对保护深海鲨鱼资源，维护海洋生态平衡具有重要意义。