4,8-DHT林地除草活性研究

胡琪瑶 ，范晓聪，杨 丽，阮 晓，章建红，王 强，郑炳松

（1.浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 杭州 311300；2.浙大宁波理工学院 生物与化学工程学院，浙江 宁波 315100）

近百年来，人类使用化学除草剂有效控制了多种杂草危害，但化学合成除草剂的大量使用也引发了环境污染、杂草耐药性增强、对非目标生物毒害等一系列严重环境问题。天然生物除草剂具有生产原料来源广泛，对非靶标生物安全、毒副作用小、环境兼容性好等特点，已成为全球农药产业发展的新趋势。4-8-二羟基-1-四氢萘酮（4,8-DHT）作为一种天然产物最初由Findlay等[1]从小柱孢属Scytalidium物种中分离出来，随后又从多种真菌以及植物中分离纯化。Eduardo等[2]通过理论计算发现其具有两种不同的构型，分别为R-(-)-(4R)-4,8-DHT（Regiolone）和S-(+)-(4S)-4,8-DHT（Isosclerone）。生物学活性研究表明，4,8-DHT对肝癌SMMC-7721细胞具有一定的体外增殖抑制作用[3]。经研究发现山核桃外果皮水提取物对双子叶植物莴苣Lactuca sativa，萝卜Raphanus sativus，黄瓜Cucumis sativus和单子叶植物洋葱Allium cepa，稻Oryza sativa，普通小麦Triticum aestivum的种子萌发和幼苗生长存在抑制作用。其外果皮水提取物经X-5大孔树脂分离，乙醇水溶液梯度洗脱，利用莴苣种子萌发与幼苗生长指标作为除草活性筛选参数，发现11个洗脱组分中以6:4，5:5，4:6，3:7的洗脱相活性最强，硅胶柱层析和葡聚糖凝胶色谱组合分离纯化目标组分，利用UPLC，NMR，GC-MS等技术手段组合解析活性组分结构为4,8-DHT[4]。目标产物经Chiral OD-H手性色谱柱拆分，获得消旋体S-(+)-Isosclerone和R-(-)-Regiolone，S-(+)-Isosclerone对测试植物反枝苋Amaranthus retroflexus，牛筋草Eleusine indica，百喜草Paspalum notatum，香附子Cyperus rotundus和西伯利亚剪股颖Agrostis stolonifera抑制活性高于R-(-)-Regiolone[5-7]。Zhang等建立了以1,5-二羟基萘为原料，五步法合成4,8-DHT外消旋体及结构改造物5-羟基-4-氧代-1,2,3,4-四氢萘-1-苯甲酸乙酯、8-羟基-4-(3-羟基丙氧基)-1-四氢萘酮、8-羟基-4-(2,3-二羟基丙氧基)-1-四氢萘酮、5-羟基-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1-苯甲酸乙酯、4-羟基-8-(3-羟基丙氧基)-1-四氢萘酮和4-羟基-8-(2,3-二羟基丙氧基)-1-四氢萘酮的化学合成方法[7-8]，并分别在实验室验证了这些新结构化合物的除草活性。

除草剂室内生物测定方法普遍采用培养皿法（种子萌发法），目标除草剂处理杂草种子，通过发芽率、鲜质量、根或茎的抑制情况计算抑制中浓度，判断目标除草剂的生物活性。除草剂田间生物测定方法则根据《农药田间药效试验准则（一）》[9]在特定田地间对靶标生物施用目标除草剂，在不同时期分别测量靶标生物的株防效、鲜质量防效等参数来判断田间试验的药效。本试验依据《农药田间药效试验准则（一）中除草剂防除林地杂草》（GB／T17980.48-2000）设置试验处理，以覆盖率、株防效为评价指标，研究4,8-DHT对东京樱花Cerasus yedoensis及紫薇Lagerstroemia indica林地中杂草的防除效果，以期为潜在除草活性物质4,8-DHT的进一步开发提供实验证据并可提高山核桃外果皮的附加值。

2 材料与方法

2.1 试验材料

供试药剂4,8-DHT（纯度＞97%）为实验室制备，配置浓度分别为9，18，36 mmol·L-1；对照药剂41%草甘膦异丙胺盐由河北廊坊中国农科院研究基地提供。

2.2 试验地概况

4,8-DHT田间试验在宁波市农业科学研究院林科所实验基地进行。该基地位于浙江省宁波市横溪镇大岙村，地理坐标为121°35′ E，29°40′ N，试验地总面积为10.67 hm2。年均气温为16.2℃，年均降水量为1 538.8 mm，年均雨日为174 d，年均日照为2 070 h，无霜期为238 d。土壤表层（0～ 15 cm）的基本理化性质为：pH 6.0，电导率88.5 μs·cm-1，有机质43.8 g·kg-1，全氮1.3 g·kg-1，全磷0.7 g·kg-1，全钾22.8 g·kg-1，碱解氮131.0 mg·kg-1，速效磷62.6 mg·kg-1，速效钾128.0 mg·kg-1。

试验地为含8科11属14种杂草的东京樱花（下文简称樱花）林地（面积1 258.8 m2，郁闭度0.69）及含7科7属8种杂草的紫薇林地（面积1 080 m2，郁闭度0.26）。其中，樱花林地杂草主要以牛筋草，香附子，水虱草Fimbristylis littoralis，母草Lindernia crustacea，耳草Hedyotis auricularia，碎米荠Cardamine hirsuta，陌上菜Lindernia procumbens，拟鼠麴草Pseudognaphalium affine，车前Plantago asiatica，通泉草Mazus pumilus，小蓬草Conyza canadensis，匙叶合冠鼠麴草Gamochaeta pensylvanica，球序卷耳Cerastium viscosum，泥花草Lindernia antipoda为主；紫薇林地主要以牛筋草，香附子，水虱草，母草，耳草，马松子Melochia corchorifolia，马唐Digitaria sanguinalis，丁香蓼Ludwigia prostrata为主。

2.3 试验设计

依据《农药田间药效准则（一）中除草剂防治林地杂草》（GB/T17980.48-2000）设计试验。对照药剂为41%草甘膦异丙胺盐（以下简称草甘膦），浓度为18 mmol·L-1（A）；供试药剂4,8-DHT浓度分别为9 mmol·L-1（B），18 mmol·L-1（C），36 mmol·L-1（D），以清水为对照（CK）。樱花林地小区面积为50 m2，小区间隔0.5 m，紫薇林地小区面积为50 m2，小区间隔0.5 m，4次重复，随机区组排列。每小区用药（水）量为0.225 L·m-2。

2.4 施药方法

4,8-DHT林地除草试验时间为2018年6-9月，试验前期调查杂草种类及株数，并进行施药前人工松土，于2018年7月12日杂草萌芽前对土壤施药一次，于8月2日对杂草幼苗茎叶喷施药一次。试验期间不施用其他任何药剂。

杂草萌芽前土壤施药方法：施药前人工松土，土壤地面喷雾，施药当天（7月12日）晴，施药后3 d无雨。

杂草幼苗茎叶喷施药方法：人工松土20 d后，对杂草2～ 3叶期的幼苗茎叶喷雾施药，施药当天（8月2日）晴，施药后3 d无雨。

2.5 调查及统计方法

在樱花林地及紫薇林地每个试验小区固定3个调查样方，每个样方面积1 m×1 m，施药后8，12，16，20 d时观察杂草生长情况，用佳能EOS 80D相机分区拍照；施药后8，20 d统计林地杂草残存种类及株数。根据调查数据，利用Excel及SPSS软件计算杂草株防治效果（以下简称株防效），并进行方差分析及多重比较，通过杂草覆盖率大小可判断杂草防除效果。计算方法如下：

图像计算杂草覆盖率：根据拍摄的调查样方，Ecognition分类软件提取杂草面积，计算杂草的覆盖率。

3 结果与分析

3.1 4,8-DHT对樱花林地杂草覆盖率的影响

根据拍摄的4,8-DHT处理樱花林地杂草调查样方（图1），计算樱花林地杂草覆盖率，结果如图2。4,8-DHT处理后，樱花林地杂草覆盖率均有所降低，且具有浓度依赖性，4,8-DHT处理浓度越高，杂草覆盖率越低。杂草萌芽前对土壤施药的杂草覆盖率明显低于杂草幼苗茎叶喷施处理，36 mmol·L-14,8-DHT药后8 d杂草的覆盖率仅为0.15%，其杂草防除效果优于草甘膦。对杂草幼苗茎叶喷施药后，杂草覆盖率降低，但防除效果不明显（图2 B）。

图1 4,8-DHT与草甘膦处理下樱花林地杂草生长情况Figure 1 Growth of weeds in C.yedoensis stand treated by 4,8-DHT and glyphosate

图2 不同施药处理下樱花林地的杂草覆盖率Figure 2 Weeds coverage in C.yedoensis stand treated by 4,8-DHT and glyphosate

3.2 4,8-DHT对樱花林地杂草防除的影响

4,8-DHT对樱花林地杂草株数、株防效的调查结果如表1。由表1可知，杂草萌芽前对土壤施药后，4,8-DHT对樱花林地杂草除香附子外均有较高的株防效。药后8 d，36 mmol·L-14,8-DHT对陌上菜、拟鼠麴草、车前、碎米荠、匙叶合冠鼠麴草的防除效果显著（P＜0.05），株防效均高达100%；药后20 d，株防效仍为78%以上。对杂草幼苗茎叶喷施处理药后8 d，36 mmol·L-14,8-DHT对碎米荠、匙叶合冠鼠麴草、陌上菜的株防效作用显著（P＜0.05），分别达100%，100%，93.8%；药后20 d时，株防效仍能保持在87%以上。

3.3 4,8-DHT对紫薇林地杂草覆盖率的影响

根据拍摄的4,8-DHT处理紫薇林地杂草调查样方图（图3），计算紫薇林地杂草覆盖率，结果如图4。由图4可知，在杂草萌芽前进行4,8-DHT土壤施药可降低杂草的覆盖率，36 mmol·L-14,8-DHT药后8 d，杂草覆盖率为0.32%；药后20 d，杂草覆盖率仅增长0.68%；与其余处理相比，36 mmol·L-14,8-DHT施药后杂草的覆盖率更低。杂草幼苗茎叶喷施处理20 d后，草甘膦处理的杂草覆盖率最低，为1.5%；其次为36 mmol·L-14,8-DHT处理，其杂草覆盖率为2.5%。

图3 4,8-DHT与草甘膦处理下紫薇林地杂草生长情况Figure 3 Growth of weeds in L.indica stand treated by 4,8-DHT and glyphosate

3.4 4,8-DHT对紫薇林地杂草防除的影响

4,8-DHT处理紫薇林地杂草株数及株防效调查结果如表2。从表2可看出，杂草萌芽前土壤施药，药后8 d，4,8-DHT抑制紫薇林地内母草、耳草的生长，且随着处理浓度的增加，防效呈明显上升的趋势，36 mmol·L-14,8-DHT处理的株防效达到100%。药后20 d，36 mmol·L-14,8-DHT对耳草、牛筋草有显著（P＜0.05）的抑制作用，株防效为100%；其次为水虱草、母草、香附子，株防效分别为66.7%，65.0%，40%，对马松子无防除效果。幼苗茎叶喷施药后，4,8-DHT各浓度处理对林地杂草的防除效果较差，药后20 d，36 mmol·L-14,8-DHT处理对耳草、牛筋草、母草、马松子的株防效仅为61.9%，50.0%，48.3%，33.3%，对香附子和水虱草无防除效果。不同施药方法对紫薇林地杂草的防除效果分析表明，4,8-DHT对杂草种子萌发期的抑制作用强于幼苗期，因此4,8-DHT适用于土壤施药。

3.5 4,8-DHT林地杂草防除效果比较

樱花及紫薇林地内杂草总数及总株防效调查结果如表3。从表3可看出，土壤施药后20 d，36 mmol·L-14,8-DHT对樱花林地中杂草的总株防效为78.5%；与茎叶喷施药处理相比，总株防效增加13.5%，杂草防除效果显著。对紫薇林地杂草茎叶喷施4,8-DHT 20 d后防除效果较差，其中36 mmol·L-14,8-DHT处理杂草的总株防效最高仅为34.6%，而36 mmol·L-14,8-DHT土壤施药后的总株防效为65.9%。4,8-DHT对林地杂草防除效果比较可知，4,8-DHT最佳施药方法为杂草萌芽前土壤施药。

表3 4,8-DH T与草甘膦处理下樱花和紫薇林地杂草总数及总株防效Table 3 Total number and control effect of weed in C.yedoensis and L.indica stands treated by 4,8-DHT and glyphosate

4 小结与讨论

化感物质作为除草剂应用的一个显著特点是具有选择性和专一性。由天然产物莎草茵为先导化合物开发的三氟羧草醚田间试验对一年生双子叶杂草反枝苋、藜Chenopodium album、狗尾草Setaria viridis具有良好的防除效果[10]；以芳香油纤精酮（leptospermone）为先导化合物开发的硝磺草酮能有效防除玉蜀黍Zea mays田内牛筋草、马唐、反枝苋等杂草，对马齿苋Portulaca oleracea无防除效应[11]；由菊科Compositae植物猪毛蒿Artemisia scoparia全草提取的猪毛蒿精油能显著防除香附子[12]。本实验中，高浓度4,8-DHT土壤施药对樱花林地陌上菜、碎米荠、匙叶合冠鼠麴草和紫薇林地耳草的防除效果显著，中低浓度4,8-DHT茎叶施药对香附子、碎米荠、马松子无防除效果，本文验证目标活性物质杂草防除选择性的同时获得了除草剂目标作用谱。

除草剂作用于杂草，可抑制杂草的营养吸收、物质合成、能量代谢、酶活性、光合作用等生理过程[13]。因抑制生理过程的不同，除草剂施用方法主要包括土壤施药法和茎叶喷施法。草甘膦为广谱型内吸灭生型除草剂，遇土钝化失去活性，适于杂草茎叶喷施[14]；乙草胺为选择性芽前处理除草剂，主要通过阻碍蛋白质合成来抑制细胞生长，适用于土壤施药[15]；环庚草醚土壤施药与茎叶喷施法均能发挥其药效[16]。本试验中，36 mmol·L-14,8-DHT樱花林地药后20 d，与茎叶喷施除草效果相比，土壤施药杂草总株防效增加13.5%；紫薇林地药后20 d，36 mmol·L-14,8-DHT土壤施药总株防效为65.9%，比茎叶喷施总株防效增加31.3%。4,8-DHT最高浓度。4,8-DHT对林地杂草防除效果比较可知，4,8-DHT最佳施药方法为杂草萌芽前土壤施药。研究结果表明，4,8-DHT作为除草剂，施用方法以土壤施药法为宜。

化感作用强弱不仅取决于植物本身的内在因素，环境因子对化感作用也具有一定的影响，这可能是解释以化感物质为基础开发的生物除草剂在不同林地间除草效应存在差异的原因。以天然产物莎草茵所开发的二苯醚类除草剂氟磺胺草醚对绿豆Vigna radiata，赤小豆Vigna umbellata及大豆Glycine max田间的铁苋菜Acalypha australis的防除效果不同，大豆田间铁苋菜的株防效为84.31%，而绿豆、赤小豆田的铁苋菜的株防效仅为73.6%[17-18]。本研究中4,8-DHT对樱花及紫薇林地内杂草的株防效有显著差异，推测可能是4,8-DHT从喷施到发挥除草效果的过程中多种因素的综合影响而导致株防效存在差异。环境因子主要有土壤因素、气候因素等，影响所施药剂的吸收及在杂草内的转移；生物因素包括林地郁闭度、杂草种类及密度差异也可导致株防效出现差异。本研究仅为特定地域内单次试验研究结果，可能影响到试验的准确性，故仍需后续试验的再次验证，试验结果可为4,8-DHT作为生物型除草剂推广应用提供理论基础，同时也在以天然产物为基础开发新型生物农药上起到积极推动作用。