知母皂苷对慢性乙醇中毒小鼠学习记忆能力和突触可塑性的影响

赵喆 张昊婧 隋海娟 刘琪 刘卓

(1锦州医科大学基础医学院药理学教研室，辽宁 锦州 121000；2铁岭卫生职业学院)

研究表明，长期过量饮酒会使大脑活动受抑制，引起神经损伤、导致学习与记忆障碍〔1，2〕。突触可塑性参与神经系统生长发育和损伤修复，在慢性酒精中毒的学习记忆障碍形成中扮演了重要角色。长期乙醇使用导致了突触可塑性功能损伤，并减少突触特异性标志蛋白的表达，而直接对酒精引起的结构可塑性分子机制的研究仍然不清楚〔3，4〕。知母皂苷(SAaB)由百合科植物知母的根茎炮制而成，有防治老年痴呆症〔5〕、抗炎〔6〕、抗凝血、抗氧化〔7〕等广泛的生物活性和药理作用。本实验探讨SAaB对慢性乙醇中毒所致小鼠空间学习记忆损害和突触可塑性相关蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器 SPF级雄性12月龄昆明小鼠，体重22～30 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK(辽)2015-0001，NO：211002300014062。SAaB由成都普瑞法科技开发有限公司提供，批号：S08039，高效液相色谱法(HPLC)分析纯度>98%，分子质量为416.64。鼠突触素(SYP)单克隆抗体、兔突触后致密蛋白(PSD)95多克隆抗体、突触小体相关蛋白(SNAP25)抗体及山羊抗兔、山羊抗鼠二抗购自Santa Cruz公司；β-actin抗体购自Beyotime试剂公司；电化学发光(ECL)试剂盒、放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，其他相关试剂由锦州医科大学药理学实验室提供〔8〕。Morris水迷宫系统购自中国淮北正华生物仪器设备有限公司，荧光显微镜购自(ZDM-500Z)德国Leica，全自动荧光和化学发光成像分析系统(Bio Spectrum 510)购自美国UVP，微量紫外分光光度计(Nano Drop 2000c)购自美国Thermo Scientific等。

1.2实验动物分组及处理 40只小鼠采用随机数字法分为正常对照组(NC组)、乙醇组(E组)和SAaB低剂量组(SL组)、SAaB高剂量组(SH组)各10只。乙醇组和SAaB组小鼠灌胃(ig)给予30%(V/V)乙醇10 ml/kg制作慢性乙醇中毒小鼠模型，对照组ig等量蒸馏水，连续4 w。灌胃同时分别对SL组和SH组腹腔注射(ip)SAaB 100、200 mg/kg，NC组和E组ip等量生理盐水，连续4 w。

1.3Morris水迷宫实验 各组进行Morris水迷宫实验，水迷宫为直径100 cm、高50 cm的圆形水池，水深25 cm，水温22～24℃，内置直径7.5 cm的可移动平台。①定位航行实验：第1～3天为学习阶段，平台高出水面1 cm置于NE象限，参照物悬挂于平台对侧。将小鼠面向池壁从距平台最远象限放入水中，若在120 s内成功找到平台，则更换入水位置进行第2次训练；若120 s内不能找到平台，由实验者将其引上平台停留10 s，每只训练4次。第4～8天移动平台至SE象限，参照物移动至平台对侧，加水使水面没过平台，记录找到平台所需要的时间(逃避潜伏期)。②空间探索实验：定位航行实验结束后的次日移除平台，参照物不动，其余方法同前。记录在目标象限游泳时间占总游泳时间的百分比，以判断记忆存储、提取及再现能力。

1.4Western印迹法测定海马组织突触相关蛋白 水迷宫试验后，每组任选4只小鼠麻醉后直接断头，收集大脑海马组织。经过组织蛋白提取、电泳、转膜、杂交、显色，测定各组海马区SNAP25、SYP、PSD95和神经元核蛋白(NeuN)表达水平变化。

1.5免疫组织化学观察海马NeuN表达 从每组中任选4只作免疫组化检测，灌流取全脑，固定，制作冰冻切片行增强免疫组织化学染色(IHC)，在荧光显微镜下观察，并进行照相及分析，观察NeuN表达情况。

1.6统计学分析 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析和Post-hoc多重比较。

2 结 果

2.1空间学习记忆能力 在定位航行实验中，各组逃避潜伏期随着训练时间的延长逐渐缩短。第4～8天，与NC组相比，E组逃避潜伏期明显延长(P<0.05)；SL和SH组逃避潜伏期较E组明显缩短(P<0.05)，见表1。空间探索实验中，与NC组相比，E组目标象限停留时间明显缩短，穿越平台次数明显减少(P<0.05)，SL和SH组在平台象限停留时间较E组明显延长，穿越平台次数明显增加(P<0.05)，见表2，图1。

表1 各组不同训练时间逃避潜伏期比较

表2 各组平台象限停留时间占总游泳时间百分比和穿越平台次数比较

图1 各组空间探索试验游泳轨迹

2.2海马组织突触相关蛋白测定 与NC组相比，E组海马组织中SNAP25、SYP、PSD95水平明显减少(P<0.01)，与E组比较，SL和SH组SNAP25、SYP、PSD95水平明显升高(P<0.01)。见表3和图2。

表3 各组海马组织中SNAP25、SYP、PSD95蛋白表达水平

图2 各组海马组织SNAP25、SYP和PSD95表达水平

2.3海马齿状回NeuN形态学变化 与NC组相比，E组海马DG区NeuN数目明显减少(红色)，细胞出现碎裂，细胞核不完整。SH组较E组NeuN表达明显增多，细胞形态及完整度均有所增强。见图3。

图3 各组海马齿状回NeuN增强免疫荧光染色(×200)

3 讨 论

研究表明，乙醇及其在代谢过程中产生的乙醛透过血脑屏障进入脑内，通过影响不同的神经通路及神经递质释放，使机体出现多种行为改变及神经损伤〔8～10〕。海马是学习和记忆的关键部位，NeuN是一种表达在成熟神经细胞核中的特异性核蛋白，研究发现长期酒精暴露使小鼠成熟神经元的数量明显减少〔11〕。本研究证明了SAaB对慢性乙醇中毒引起的神经元损伤具有保护作用。

在神经信息传递过程中，突触是传递的关键部位，也是神经可塑性变化中最敏感的部位，在神经系统发育过程中，不断有新的突触形成〔12〕。如损伤、学习等适应性变化的过程中，突触表现出强大的变异性，通过从神经元到神经环路的适应性变化以维持神经功能相对稳定，这种变化即突触可塑性。在突触前、后膜中，存在许多可调节突触可塑性的信号分子，突触前膜上的SNAP25，为神经递质释放所必需的突触前膜蛋白〔13〕，研究发现酒精处理的小鼠大脑中SNAP25含量明显减少，小鼠出现明显的学习记忆障碍，表现为Morris水迷宫试验潜伏期延长，这一结果与本研究相一致。SYP和PSD95虽产生部位不同，但都与突触的形成和成熟密切相关〔14〕。其中SYP数量减少提示突触数量减少，突触囊泡减少，进而影响神经递质的释放，SYP丢失程度与记忆缺失程度成正相关，在行为上表现为学习记忆障碍〔15〕。而突触后致密物质是突触可塑性中最为敏感的物质，小鼠连续饮用酒精2个月后突触后致密物质厚度显著变小，说明其内的各种蛋白的量减少，而这些蛋白减少必定会使神经递质的传递速度降低〔16〕。本研究证明SAaB可明显改善这种损伤性改变，其机制可能与通过增加突触相关蛋白，进而影响突触可塑性有关。

综上，SAaB可明显改善慢性乙醇中毒所致的小鼠空间学习记忆损害，可能是通过对海马组织神经元的保护和调节突触可塑性相关的信号分子有关。