豁痰通络方对大鼠球囊损伤后内膜增生的干预机制

沈娟娟 褚颖 苏颖 邓悦 路方平 马金玲 于克英

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

冠状动脉粥样硬化性心脏病是中老年多发病，现代医学认为，动脉管壁逐渐增厚、变硬并且失去其弹性，动脉管腔逐渐缩小变细，是动脉粥样硬化的主要病理特点。而病变的内膜不断累积脂质及复合糖类，形成纤维组织增生，导致形成斑块阻塞动脉，动脉进一步狭窄，影响血液循环，造成心肌组织缺血缺氧〔1〕，影响中老年人的健康及生活质量。血管重建术是现阶段治疗冠心病介入的重要手段。其优点包括应用简便、术后安全、疗效有效、术后创伤小，临床适用范围广等。已成为治疗冠心病广泛应用的技术。然而术后易形成血管再狭窄，且复发率高，出现术后再狭窄的比率高达30%以上，这也成为该领域的难点〔2〕。血管再狭窄的主要病理机制与血管内膜增生呈正相关。本研究探讨豁痰通络方对大鼠球囊损伤后内膜增生的干预机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 ①实验动物：北京维通利华实验动物技术有限公司提供SPF级雄性大鼠60只，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001。②实验试剂：豁痰通络方，长春中医药大学提供，生药含量：2.33 g/ml。辛伐他汀片，远大医药中国有限公司，批号：H20000107。低分子肝素钠注射液，杭州九源基因工程有限公司；显影定影试剂盒，Santa Cruz公司。

1.2制备模型 SD大鼠术前皮注低分子肝素钠抗凝1 h后进行造模〔3〕。大鼠麻醉后左颈总动脉进行球囊损伤术，并给予青霉素皮下注射抗炎，低分子肝素钠皮下注射抗凝。假手术组大鼠仅分离结扎。

1.3实验分组 SD大鼠随机分为6组，其中假手术组、模型组给予蒸馏水灌胃，豁痰通络方组给予1.633 g/ml灌胃；辛伐他汀组方给予0.119 mg/ml灌胃；豁痰通络方+辛伐他汀组给予中药组方1.633 g/ml、辛伐他汀0.119 mg/ml灌胃，术后次日灌胃给药，连续7 d。以上所有药物均按1 ml/kg体重配制给药。

1.4苏木素-伊红(HE)染色法检测大鼠颈动脉内膜增生 常规脱蜡、染色、脱水、封片，制备石蜡切片。HE分析：蓝色染色见细胞核，淡红色染色见细胞质，观察内膜面积增生情况。

1.5免疫组化染色法 根据免疫组化试剂盒说明常规操作。核因子(NF)-κB 抗体效价1∶100免疫组化图像分析：棕黄色染色为阳性反应。NF-κB在胞质和胞核表达。

1.6Western印迹实验 取冻存于液氮的血管标本，总蛋白提取后采用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)试剂盒测定浓度，配制10%分离胶，5%浓缩胶，设置恒压80 V，30 min后将电压设置为120 V(恒压)，90 min结束电泳。转膜设置恒定电流 400 mA，转膜 90 min。采用脱脂奶粉进行室温封闭 120 min，加入一抗，IκBα、NF-κB p65 25℃水浴箱中震荡孵育1 h后4℃过夜。二抗孵育25℃水浴箱中2 h。应用Quantityone凝胶图像分析计算积分光密度，以IκBα、NF-κB p65蛋白与内参照β-actin蛋白积分光密度的比值分别表示IkBα、NF-κB p65蛋白的相对含量。

1.7统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1HE染色法检测大鼠颈动脉变化 假手术组内膜弹力正常，可见单层内皮细胞；模型组平滑肌细胞排列紊乱且可见增厚的内膜，横切管腔可见向心性或偏心性狭窄，表明模型形成。与模型组比较，豁痰通络方组、辛伐他汀组、豁痰通络方+辛伐他汀组，内膜增生情况已见明显缓解。见图1。

图1 各组颈动脉内膜增生情况(HE，×100)

2.2免疫组化染色法检测大鼠颈动脉NF-κB的表达 模型组胞核呈棕黄色，并见棕黄色沉积颗粒为阳性反应。假手术组无阳性着色。豁痰通络方组、辛伐他汀组与模型组比较阳性着色减少，豁痰通络方+辛伐他汀组与模型组比较阳性着色明显改善。见图2。

图2 各组颈动脉NF-κB蛋白表达(DAB，×400)

2.3Western印迹法检测大鼠颈动脉 IκB-α蛋白的表达 比较模型组，豁痰通络方组、辛伐他汀组、豁痰通络方+辛伐他汀组均能够极显著降低p-IκB-α的蛋白表达量(P<0.05)，极显著增加IκB-α蛋白的表达量(P<0.01)。见表1，图3。

表1 各组大鼠颈静脉组织p-IκB-α、IκB-α、p-p65和p-p65蛋白表达

1.假手术组；2.模型组；3.豁痰通络组；4.辛伐他汀组；5.豁痰通络+辛伐他汀组；下图同图3 Western印迹检测p-IκB-α的蛋白表达

2.4Western印迹法检测大鼠颈动脉 NF-κB p65蛋白的表达 比较模型组，豁痰通络方组、辛伐他汀组、豁痰通络方+辛伐他汀组均能够显著降低p-p65的蛋白表达量(P<0.05)，极显著增加 p65 蛋白的表达量(P<0.01)。见表1，图4。

图4 Western印迹检测p-p65的蛋白表达

3 讨 论

3.1中医经典理论对“心”及“血脉”的阐释 《素问·灵兰秘典论》曰：“心者，君主之官，神明出焉”〔4〕。心，生命活动的主宰，权重可比君主，心的主要的生理功能包括：主人的精神意识思维活动，主血脉。《素问·六节藏象论》曰“心者生之本，神之变也；其华在面，其充在血脉；为阳中之太阳，通于夏气”〔4〕。不但阐明了心的主要的生理功能，亦以心为核心，以“四时五藏阴阳”为整体观，论述了心与自然阴阳变化及人体形体官窍的对应关系。《素问·脉要精微论》曰：“夫脉者血之府也”〔4〕。《灵枢·决气》 曰：“何谓血？岐伯曰：中焦受气取汁，变化而赤，是谓血。何谓脉？岐伯曰：塞遏营气，令无所避，是谓脉”〔4〕。阐明气血在脉道中运行，脉道是气血运行的通道，脉道能约束营血的运行，令其不妄行于外。而气血是人体内贮藏于脏腑间的精微物质，可以濡养机体，是人体一切生命活动的物质基础。然《素问·灵兰秘典论》曰：“主不明则十二官危，使道闭塞而不通，形乃大伤”〔4〕。若心的功能失常，则影响其他脏腑不安，使其相互联系的道路闭塞不通，影响气血的正常运行，气血运行失常，气机失调，阴阳失和，形体受到极大的损伤。故心藏神，主血脉，血脉病变，亦以论心、治心为所倚重。

3.2中医理论对血管重建术后再狭窄的认识 中医学认识人体与疾病的关系亦是从“天人相应”、“人体为有机相互联系统一的整体”这一整体观思想出发〔5〕。《素问·经脉别论》曰：“生病起于过用”〔4〕。言明无论是自然界外来气候、情志变化、日常饮食及劳逸超过人体承受的常度后，均影响人体阴阳失调，脏腑经脉气血运行失常，气机失和，导致人体发生疾病。

人食水谷五味，饮食没有节制或节律，过度偏嗜一味，导致相应藏气偏盛，人体五脏贮藏气血津液，日久影响五脏功能。例如《内经》中言：“饮食自倍，肠胃乃伤”〔4〕。“高梁之变，足生大丁”〔4〕。 也就是说过食肥甘厚味之品，容易助湿生热，湿热互结，影响人体脾胃的生理功能，脾失运化，脾气不升，不能化气行水，聚水成痰，痰浊阻遏阳气循行，气血失和，壅阻于心脉发为胸痹。

大多数患者在血管重建术后均存在精神紧张甚至抑郁，中医学认为情志由五脏产生，如果感受外界刺激，情志失于调摄，可反作用于人体五脏。例如，过度忧思竭虑易伤及脾脏，影响脾的生理功能，失于运化水谷及水液，气机壅滞，水液内停，形成痰湿〔6〕。以及肝气失于疏泄，肝气上逆，气机壅塞，郁而化火，灼津成痰。且肝气郁结，持久不愈，木郁乘脾土，亦能影响脾的功能。脾胃为后天之本，气血化生之源，若伤及脾胃，则脾土无力统摄，失于运化，津液停聚，聚而成痰，形成痰瘀互结，瘀阻心脉〔7〕。形成了气滞、血瘀、痰浊、热毒，四者又互为因果，久留不去，伏藏与人体脏腑中，若有内外因素干扰，必至血脉再次瘀阻。

3.3现代医学对血管重建术后再狭窄的认识 血管再狭窄是指已经狭窄的血管经血管重建术后再次出现新生的狭窄，这是由于多种细胞及生长因子介导的血管修复性反应〔8〕，而其影响因素比较复杂。

血管再狭窄的基础和关键环节在于成纤维细胞生长因子刺激血管平滑肌细胞，血管平滑肌细胞受到刺激后，进一步迁移并增殖，并向血管内膜下迁移〔9〕。同时改变了血管平滑肌细胞表型，也损伤了内皮细胞的功能。例如，在治疗血管狭窄时，机械性扩张会影响血管内膜的损伤程度，撕脱血管内皮细胞，暴露血管内皮下胶原和基质，导致血管内皮下的血小板附着，影响血管内皮细胞的功能，并且使黏附因子附着于血管内膜，形成新的管腔内壁血栓〔10〕。同时，血管内皮细胞功能失常也会减少肝素样物质的传递，肝素样物质可抑制血管平滑肌细胞的增殖，肝素样物质对于血管平滑肌细胞的迁移增殖，具有反向调节作用〔11〕。

改变血管壁张力、血管外膜纤维化、副交感神经的反向作用、炎症反应等都在血管再狭窄的发生发展过程中起到重要的作用〔12〕。机械性扩张血管也可引起炎症反应，撕脱血管内皮细胞，炎性细胞浸润释放溶酶体酶，导致局部出现炎症反应。炎症反应对于血管内膜增殖，迁移并再次形成血栓起着重要的正向调节作用，可见炎症反应也参与了血管再狭窄形成机制〔13〕。

多种信号转导通路与血管再狭窄发生机制关系密切，这些外界的信号转导通路交织构成了一个复杂的信号调节网络〔14〕，血管内皮细胞在受到刺激后，通过细胞内受体，跨过细胞膜传递到细胞核内，影响内皮增殖相关基因转录，改变细胞周期，导致血管平滑肌细胞出现异常的增殖和迁移〔15〕。而这些信号转导通路的作用比较复杂，也成为影响血管重构的重要因素。

例如脂多糖、氧化应激、炎性细胞因子等能够刺激NF-κB信号转导通路，NF-κB 信号转导通路能够影响细胞炎性因子及黏附因子的表达〔16〕，在细胞质内NF-κB与IκB家族结合，IκB家族中的IκB-α与NF-κB家族中的 p50/p65亲和力较高，IκB-α在一定程度上可以抑制NF-κB 活化〔17〕。在炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的刺激下，NF-κB还可通过抑制血管平滑肌细胞的凋亡对细胞周期产生影响，引起平滑肌细胞堆积、内膜过度增生，参与炎症、感染、免疫反应、细胞凋亡等过程，从而在血管再狭窄中扮演重要角色〔18〕。

MAPK信号转导通路可通过引起细胞核产生反应，在细胞多种功能中起着重要的调控作用〔19〕，尤其与细胞增殖、分化与凋亡及细胞骨架重构的机制产生关系密切。细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、应激激活的蛋白激酶(SAPKs)，又称为 JNK及蛋白激活激酶(p38MAPK)是组成MAPK信号转导通路的重要成员〔20〕。

Ras-Raf-MEK-ERK1/2则是血管平滑肌细胞增殖的经典信号转导途径，激活上游激活蛋白，激活Raf，进而可以依次激活 MEK 和 ERK1/2〔21〕，ERK1/2信号转导通路在激活后，对于细胞的增殖、迁移具有重要的调控作用，并且能够影响相关炎症因子，例如TNF-α、IL-1β、IL-6的表达〔22〕。球囊损伤后ERK1/2 蛋白活性增高，在血管损伤后7～14 d仍然高表达，提示 ERK1/2 可能参与了血管再狭窄的形成过程〔13〕。转染血管平滑肌细胞可以抑制 PTCA 术后损伤血管组织中ERKs 和 JNKs 的活化水平，引起内膜血管平滑肌细胞增殖降低〔23〕。有学者分别应用 MAPK 通路中ERK、JNK 和 p38 的特异性抑制剂 PD98059、SP600125 和 SB202190，在幼鼠动物模型进行体外的实验研究〔24〕，发现它们不同程度地减弱了血管平滑肌细胞的增殖，其中以 ERK 特异性抑制剂 PD98059 的抑制作用最大。以上研究充分说明 MAPK 信号通路在调控血管平滑肌细胞的增殖及血管成形术后的再狭窄中的作用。

本研究发现，豁痰通络方能够显著降低 p-IkB-α、p-p65的表达，显著增加IκB-α、p65表达量。豁痰通络方可以有效抑制大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的增殖，可能通过调控NF-κB信号通路来抑制新生内膜的增殖。

NF-κB 信号转导通路在血管再狭窄过程中影响血管平滑肌细胞增殖起着非常重要的调控作用，根据血管再狭窄生理及病理变化进程，从分子生物学角度来研究影响细胞信号通路的基因治疗等方法来抑制血管再狭窄〔25〕，可取得了良好的远期效果，为我们提供一条新的再狭窄防治思路。总之，针对血管平滑肌细胞增殖信号转导调控机制的研究，将为再狭窄等血管增殖性疾病的防治提供充分的理论依据。