类风湿关节炎合并干眼病患者血清中差异蛋白的分析

李晓玲 武艳梅

(1锦州医科大学，辽宁 锦州 121000；2锦州医科大学附属第三医院)

类风湿关节炎(RA)是一种累及全身多系统的慢性进行性自身免疫性疾病，其主要临床特征为滑膜关节的慢性炎症性病变，并合并关节外多器官病症〔1,2〕。干眼病(DED)是一种泪液和眼表疾病〔3〕，是RA最常见的眼部病症，其在RA患者中发病率可达19%～31%〔4〕，并常因未能及时发现和得到有效治疗导致RA合并DED患者失明，使患者的生活质量受到严重影响。因此，早期发现RA患者的眼部病变，对于患者的治疗和预后非常重要。本研究通过非标记(Label-free)定量蛋白质组学技术筛选RA合并DED患者血清中差异蛋白，并分析其功能及参与RA合并DED发病的生物学过程，为寻找诊断RA合并DED的早期血清学标志物及进一步探讨RA合并DED的发病机制提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年6月至2019年6月在锦州医科大学附属第三医院风湿免疫科确诊为单纯RA患者20例作为对照组，男7例、女13例，平均年龄(54.5±5.39)岁；同时选取RA(病程1～20 年，平均10年)合并DED患者20例作为观察组，男4例、女16例，平均年龄(56.8±4.92)岁。经统计，两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。该研究方案经过医院伦理委员会讨论通过，所有患者或其监护人对本研究知情，并签署了知情同意书。

1.2入选标准 纳入标准：RA诊断依据2010年美国风湿病学会(ACR)/欧洲抗风湿病联盟(EULAR)关于RA新分类标准〔5〕；RA合并DED诊断依据2013年中华医学会眼科学分会角膜病学组《干眼临床诊疗专家共识(2013 年)》中提出的干眼诊断标准〔6〕。排除标准：高血压、糖尿病及心、脑血管疾病等全身疾病者；患有其他自身免疫性疾病、急慢性感染，肿瘤病史、肝肾损害者；1年内有激素和免疫抑制剂等特殊用药史者。

1.3主要试剂和仪器 聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)定量试剂盒购自碧云天生物技术公司，其余试剂均购自Bio-Rad公司。C18 Cartridge(SPEC18柱)、C18 上样柱、C18分析柱、纳升级液相色谱仪(EASY-nLC 1000)、Q Exactive质谱仪均购自Thermo Scientific公司，MaxQuant (版本号1.5.3.17)分析软件购自德国的Max Planck 生物化学研究所，电泳系统(EPS200)和化学发光仪(Tanon 4600)全自动化学发光图像分析系统均购自上海天能科技有限公司。

1.4蛋白的提取和酶解 采集所有患者空腹静脉血3 ml，离心、分离血清。用Sartorius超滤管(10 kD)对血清样本进行超滤浓缩后，加入SDT 裂解液：4%(W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)、100 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.6)和0.1 mol/L的二硫苏糖醇(DTT)，将样品置沸水浴裂解 15 min；取出样品，上离心机，14 000 r/min离心20 min，提取上清液中的蛋白；用BCA检测法测定蛋白浓度；取100 μg蛋白，加入胰蛋白酶(1∶50)，用超滤辅助样品制备(FASP)方法进行胰蛋白酶酶解；用C18 Cartridge对酶解后的肽段进行脱盐后，冻干肽段；用40 μl 0.1%甲酸溶液复溶冻干后肽段，于光密度A280下测定肽段浓度。

1.5数据采集 采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。取冻干后肽段2 μg，用40 μl 0.1%甲酸溶液复溶后，用纳升级液相色谱仪(EASY-nLC1000)对肽段进行分离，色谱条件：采用C18-A2色谱柱(10 cm×75 μm，3 μm)，以0.1%甲酸水溶液(缓冲液A)-0.1%甲酸乙腈溶液(缓冲液B)为流动相，流速300 ml/min，柱温55℃，进样量4 μl。用Q-Exactive质谱仪对分离后的肽段进行分析，质谱条件：扫描方式为正离子和自动获取数据模式，电压2 100～2 400 V，一级扫描范围为300～1 800 m/z、一级分辨率为70 000 at 200 m/z、自动获取控制目标为1e6、最大驻留时间为50 ms、动态排除时间为60.0 s；采集多肽和多肽碎片质量电荷比的方法和条件：每次对肽段全扫描后，采集20个碎片图谱，MS2激活类型为高能诱导碰撞解离方式(HCD)，其中隔离窗为2 m/z、二级质谱分辨率为17 500 at 200 m/z、碰撞能量为30 eV、底部填充剂为0.1%。

1.6蛋白的鉴定和定量分析 采用MaxQuant软件对质谱数据进行分析，并对蛋白质进行鉴定和定量分析，其质谱分析原始数据为RAW文件，以倍数上调>2倍或下调<0.5倍，且P<0.05的标准筛选差异蛋白质。

1.7生物信息学分析 采用Blast 2GO软件对差异蛋白质进行基因功能(GO)注释，通过Fisher精确检验后，对差异蛋白质进行GO注释的富集分析，用Cluster3.0软件对差异蛋白质的表达量进行层次聚类分析。

2 结 果

2.1蛋白鉴定和定量分析结果 本研究共鉴定到蛋白345种，对照组297种，观察组298种，两组间共有320种蛋白发生重叠(图1)。通过定量分析，以观察组/对照组蛋白表达差异倍数上调>2倍或下调<0.5倍且P<0.05的筛选标准，共筛选出13种差异表达蛋白，其中上调蛋白9种、下调蛋白4种，见图1、表1。

A：对照组；B：观察组；横坐标为差异倍数(以2为底的对数变换)，纵坐标为差异显著性(以10为底的对数变换)，横、纵坐标值距离 0 点越远表示差异越大；红色圈为差异表达蛋白(倍数大于2.0倍，且P<0.05)，黑色圈为无差异变化蛋白图1 蛋白定量结果火山图

表1 差异蛋白

2.2生物信息学分析结果

2.2.1差异蛋白GO功能的富集分析结果 筛选出来的13种差异蛋白主要参与多细胞生物过程、女性妊娠、外源凋亡信号通路的负调控、外源凋亡信号通路的调控和凋亡信号传导通路负调控等重要的生物学过程(BP)，同时还参与细胞内非膜结合细胞器、超分子纤维、超分子复合物、非膜结合细胞器和超分子聚合物等细胞组分(CC)，并具有寡糖结合等分子功能(MF)，见图2。

颜色梯度代表P值大小，条形图上方是富集因子图2 富集分析的差异蛋白前20位

2.2.2差异蛋白聚类分析结果 以倍数上调>2倍或下调<0.5倍，且P<0.05筛选标准得到的差异蛋白可有效地将两组分开，表明本研究差异表达蛋白筛选的合理性和准确性，见图3。

A：对照组；B：观察组；横坐标为样本，纵坐标为差异蛋白；图中每个小方格代表一种蛋白，红色部分为上调蛋白、蓝色部分为下调蛋白，表达量越多颜色越深；每行为每个蛋白在不同组中的表达量情况，每列为每个组中所有差异蛋白的表达量情况；上方树形图为观察组和对照组数据的聚类分析结果，左侧树状图为不同蛋白数据的聚类分析结果 图3 差异蛋白聚类分析结果树形热图

3 讨 论

非标记定量蛋白质组学技术是通过液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白进行相对定量，筛选目的蛋白，其近年来广泛被用于差异蛋白的研究〔7，8〕。本研究共筛选出了13种差异蛋白，9种蛋白表现为上调、4种蛋白表现为下调。

PRDX2是一种重要的抗氧化剂，通过抗氧化活性参与细胞的炎症和免疫反应，在免疫调节中充分发挥氧化还原酶的作用〔9〕。有研究表明，氧化损伤和炎症反应共同参与了DED的发病，在实验动物饲料中加入抗氧化剂后，则发现实验动物眼表上皮细胞的氧化损伤减轻〔10〕。SAA是由肝细胞产生的一种急性时相蛋白，当机体发生炎症感染或损伤时，其可迅速升高，如RA、糖尿病肾病等患者血清中SAA含量明显升高，是诊断机体炎症感染的一个灵敏指标〔11～14〕，有学者认为炎症反应是各类型DED发病的共同机制〔15，16〕。SAA1是SAA家族中的一员，共有SAA的生物学特性。本研究结果表明RA合并DED患者体内存在氧化应激和炎症反应，二者均可作为诊断RA合并DED的早期血清学标志物。

REG为免疫炎症调节因子，在炎症、肿瘤等多种疾病或受损组织中均有表达，具有促进细胞增殖、分化和抑制细胞凋亡的生物功能〔17〕，其高表达可引起自身免疫性疾病的发生，并促进病情的发展，因此又被认为是一种自身抗原〔18〕。 REG3α为REG 家族中一员，具有抗炎等保护作用〔19〕。补体因子(CF)H和CFHRP是补体系统激活途径中的调节因子，CFH 在补体活化过程中起抑制作用，CFHRP通过与CFH竞争性结合补体 C3b，从而影响 CFH 对补体的抑制功能〔20，21〕。一些自身免疫性和炎症性疾病的病理过程与补体的过度激活和抑制不足相关，如RA患者关节滑液中补体持续激活〔22〕。CFHRP3是CFH家族的一员，可通过与CFH竞争性结合C3b，促进补体的激活〔23，24〕。

本研究首次在RA合并DED患者血清中检测到REG3α和CFHRP3，且均显示为上调，我们将在后续的研究中验证二者能否作为诊断RA合并DED的早期血清学标志物。Ig也称抗体，是机体体液免疫应答时B细胞产生的重要免疫效应分子，在机体抵抗外来病原体中发挥着重要的作用。Ig由5条重链(H链，分为γ链、α链、μ链、δ链、ε链)和2条轻链(L链，分为κ型和λ型)组成，L链阳性或升高多见于多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、巨球蛋白血症、淀粉样变性等〔25～27〕，H链升高多见淋巴细胞和浆细胞的恶性肿瘤〔28，29〕。研究发现，RA患者体内存在B细胞反应，产生抗瓜氨酸化蛋白抗体 (ACPA)等自身免疫抗体，参与RA的病理改变〔30，31〕；干燥综合征、RA等自身免疫系统性疾病患者机体免疫系统出现异常，眼成为自身抗体攻击的靶器官，泪腺被大量的淋巴细胞浸润，腺体分泌功能障碍，从而导致严重的DED〔32〕。本研究结果表明这些Ig均可能参与了RA合并DED发病过程中的体液免疫反应，因处于不同的病理改变时期或B细胞分化的不同阶段，故表现为上调或下调，在诊断RA合并DED时，可作为血清学参考标志物。

LP(a)为富含胆固醇的血浆脂蛋白，主要在肝脏中合成，通过诱导内皮细胞趋化因子 I-309 活性的增加，导致血管壁损伤和炎性反应〔33〕，同时Lp对于哺乳动物细胞外脂质的包装、储存、运输和代谢起着重要作用，脂质是泪膜的关键组成部分，主要是维持角膜表面光滑并防止眼表泪液过分蒸发。本研究结果表明RA合并DED患者体内可能存在脂质代谢紊乱的生物过程，使泪膜脂质含量发生了变化，导致睑板腺功能障碍，引起泪膜不稳定，而发生DED，所以LP(a)上调可作为诊断RA合并DED的一个血清学参考指标。妊娠区蛋白(PZP)是人血浆中一种大分子糖蛋白，与α-1巨球蛋白(α1M)、α-2巨球蛋白(α2M)及补体C3、C4、C5同属于人类α巨球蛋白家族(αMS)，存在人脑脊液、关节滑液和血液中。PZP与α2M具有同源性，具有广谱的蛋白酶抑制作用，在IL-6、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF) 等细胞因子免疫应答反应和肝抗菌肽、瘦素等激素调节方面发挥着重要的作用〔34，35〕。本研究首次在RA合并DED患者血清中检测到PZP，显示为表达下调，其可能参与了RA合并DED发病过程，是否能作为诊断RA合并DED早期血清学标志物，两作进一步的研究进行验证。

血红蛋白(Hb)是动物体内最重要的呼吸蛋白之一，主要在脊椎动物的红细胞内表达，不仅具有储存能量、维持渗透压、抗菌和发挥类酚氧化酶活性等多种生物功能，同时在宿主抵抗病原体入侵、调控机体天然免疫应答过程中也发挥了重要作用〔36〕。正常人有3种血红蛋白：HbA、HbF、HbA2，HbA为成人红细胞中的主要血红蛋白，分为HbA1、HbA2、HbF，其中HbA1是血红蛋白在代谢过程中与葡萄糖相结合的产物，与血液中葡萄糖水平成正比，因此可间接反映机体糖代谢情况〔37〕。本研究发现，在RA合并DED患者血清中HbA1表达为下调，其是否与RA合并DED患者泪液渗透压升高、角膜上皮细胞屏障遭到破坏、细胞活性降低等生物过程相关，能否作为诊断RA合并DED早期血清学标志物，将作进一步的研究。