静电纺丝法制备ZnO构建酪氨酸酶生物传感器检测邻苯二酚

李纯，孙丽霞，孙建华，周利琴，徐大鹏，张友全，廖丹葵

（广西大学化学化工学院，广西石化资源加工及过程强化技术重点实验室，广西南宁530004）

近年来，中国化工行业的迅速崛起提升了人们的生活水平，但与此同时也使得中国水资源污染问题越来越严重。以酚类物质为例，它对人体、动植物具有较大毒性，如邻苯二酚会抑制中枢系统，干扰白细胞DNA的合成，当其处于0.1～0.2mg/L范围时，鱼肉会存在异味，高浓度含酚废水会使农作物枯死、减产[1]；而炼油、炼焦等工业生产过程所产生的废水中均含有酚类物质，如何快速准确检测工业废水是否达到国家排放要求也成为了研究的热门领域。

电化学生物传感器在生物分析、环境监测和工业领域变得越来越重要。酪氨酸酶生物传感器中的酪氨酸酶被称作酚类氧化酶，由于其具有简单、高选择性和成本相对较低的优点而受到广泛研究，且已被广泛用于酚类化合物的检测[2-3]。针对生物传感器，酶在合适基质上负载及其稳定性是保证生物传感器具有优异性能的重要因素。酶可通过物理吸附、交联、自组装、加入碳糊、聚合物和溶胶凝胶等多种方法实现酶的固定化；另一方面，纳米结构载体由于具有较高的比表面积、较高的酶载量、理想的微环境以及酶活性位点与电极之间可直接电子转移的优点，能很好地保持其生物活性[4]，利用二氧化钛（TiO2）、碳纳米管和ZrO2/壳聚糖等载体制备酪氨酸酶生物传感器均有报道[5-7]。氧化锌（ZnO）由于具有较高的等电位点（IEP，约为9.5）而适宜于吸附等电位点低的蛋白质，同时ZnO的生物相容性较好，因此以此为载体负载酶对保持酶活性具有积极作用。由于微纳米纤维材料的大比表面积可有效地提高生物传感器的性能，而大规模制备ZnO 微纳米纤维，静电纺丝是最有效的技术[8]。因此，本文采用静电纺丝技术合成了ZnO 微纳米纤维，并研究了该材料制备酪氨酸酶生物传感器检测邻苯二酚，期待制备一种方便高效的生物传感元件。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

玻碳电极、Ag/AgCl 电极、铂片电极，中国武汉高仕睿联科技有限公司；酪氨酸酶（酶活力7164U/mg），德国Sigma Aldrich 公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVP，K88-96），上海阿拉丁试剂有限公司；乙酸锌，国药集团化学试剂有限公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF），天津富宇精细化工有限公司；壳聚糖（CS），浙江金壳生物化学有限公司；多巴胺、邻苯二酚、葡萄糖、尿素，上海麦克林生化科技有限公司。

静电纺丝机，E02型，广东佛山轻子精密测控技术有限公司；电化学工作站，IviumStat型，荷兰Ivium Technology 公司；马弗炉，L40/12 型，德国Nabertherm 公司；X 射线双晶粉末衍射仪（XRD），RIGAKU型，日本株式会社理学公司；扫描电子显微镜（SEM），S-3400N型，日本日立公司。

1.2 ZnO微纳米纤维的制备

称取1.1478g PVP 溶于5mL DMF 溶剂，称取1.5000g 乙酸锌溶于5mL 纯水，待两溶液充分混合并在密封条件下搅拌12h即得所需纺丝液。将纺丝液注入针管中，针头与接收鼓前端的距离为17cm，设置正负电压差约为16kV，纺丝速率为0.6mL/h，设置完成后进行纺丝操作得ZnO前体。

将ZnO前体置于马弗炉中进行煅烧，煅烧时升温速率设置为1℃/min，升温至650℃后保温2h 得到ZnO微纳米纤维。

1.3 Tyr/ZnO/CS/GCE工作电极的制备

将玻碳电极用Al2O3抛光粉反复打磨并用水冲洗干净，按照水、乙醇∶水=1∶1、水、硝酸∶水=1∶1、水的顺序对电极进行超声处理直至电极表面呈镜面状。再用1mol/L H2SO4溶液对玻碳电极进行电化学清洗，当电极在5.0mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6（1∶1）溶液中（含0.1mol/L KCl）的CV 曲线氧化峰与还原峰差值在100mV 以内后即可清洗保存备用。

称取一定质量ZnO加入超纯水中得到样液，分别量取样液和0.3mg/mL的酪氨酸酶溶液各10μL充分混合后滴加在处理过的玻碳电极上，再滴加7μL浓度为2mg/mL 的CS 溶液，置于4℃条件下干燥一夜即得Tyr/ZnO/CS/GCE工作电极。

1.4 结构与形貌表征

采用SEM 观察所制材料的微观形貌，采用XRD表征材料的晶型结构。

1.5 电化学测试

实验采用三电极体系，对电极采用铂片电极，参比电极采用Ag/AgCl 电极，工作电极为自制Tyr/ZnO/CS/GCE 电极，采用IviumStat 型电化学工作站进行性能测试。采用CV 在氧化还原探针为5.0 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6（1∶1） 溶 液（含0.1mol/L KCl），扫描范围为-0.4～0.8V 条件下进行不同扫描速率下CV测试，采用交流阻抗法（EIS）对不同工作电极进行EIS测试；工作电势设为-0.2V，采用计时电流法在不同浓度邻苯二酚溶液中进行IT 测试，利用公式LOD=3σ/S 计算最低检测限（LOD），其中σ为未加邻苯二酚时电流值的标准偏差（10 次重复），S 为校准曲线的斜率（实验过程见图1）。

图1 实验过程示意图

2 结果与讨论

2.1 ZnO形貌及结构表征

图2(a)为煅烧后ZnO的SEM图，可知煅烧后材料整体仍保持粗细均匀的纤维状，纤维直径约为400nm，且该纤维表面不光滑，由近似球状的颗粒连接而成，原因是在制备时未加入表面活化剂，导致表面张力过大使纳米纤维转化为珠状颗粒[9]，这为酶的附着提供了更多的附着位点[10-11]。图2(b)为Tyr/ZnO/CS电极材料的SEM图，可知酪氨酸酶可附着在纳米纤维之间空隙中，且仍可基本保持ZnO的纤维形貌。

从图2(c)煅烧后ZnO材料的XRD图及其对应的标准卡片比较可知，ZnO为六方晶系，其主衍射峰可完全与ZnO标准卡片对应，说明静电纺丝法所制前体经过煅烧后可合成高纯度的ZnO微纳米纤维。

2.2 Tyr/ZnO/CS/GCE工作电极电化学性能检测

图3为Tyr/ZnO/CS/GCE工作电极在不同扫描速率下测得的CV 曲线及峰电流与扫描速率平方根的关系曲线。该电极有明显的氧化还原峰，对比发现基于电化学沉积法制备的ZnO生物传感电极在相同测试条件下氧化还原峰峰电流值与本试验结果基本接近，说明Tyr/ZnO/CS/GCE 工作电极具有较好的直接电子传输能力[12]。而图3(b)工作电极氧化和还原峰峰电流值与扫描速率平方根的线性关系表明该工作电极在反应时控制步骤为扩散控制[13-14]。

2.3 工作电极性能测试条件优化

2.3.1 pH对工作电极性能的影响

图2 ZnO形貌及结构图

电解液pH 会影响电极性能，当酶活性大时，底物邻苯二酚单位时间被氧化还原的量增大，表现为工作电极的电信号增强。将工作电极置于不同pH的1mmol/L 邻苯二酚溶液中进行CV测试，结果见图4。由图可知，还原峰峰电流响应值在pH=5～7.5 范围先增大后减小，在pH=5.5 时电流响应值最大为-19.97μA，这是因为酪氨酸酶在酸性条件下活性更好[15]，因此使得还原峰峰电流响应值在酸性条件下更大。

图3 Tyr/ZnO/CS/GCE工作电极的电化学性能图

2.3.2 ZnO添加量对工作电极性能的影响

固定化酶载体量会对电流响应产生影响，考察了ZnO 负载酪氨酸酶的工作电极对应CV 曲线中还原峰峰电流响应值的变化情况，如图5 所示。在-0.4～0.8V 的扫描范围内，ZnO 浓度为3mg/mL 时还原峰峰电流响应值最大为-22.20μA，当ZnO 浓度过大时峰电流值反而减小，这是由于ZnO添加量过多会增加电流阻力，从而导致电子转移能力下降[16]；而当ZnO浓度过小时酪氨酸酶分子在载体表面可能形成拥挤并增大对扩散过程的限制程度，这会使还原峰峰电流值减小[17]。

2.3.3 温度对工作电极性能的影响

温度是影响电极性能的重要因素，底物邻苯二酚单位时间被氧化还原的量增大，表现为工作电极的传感信号增强，图6为不同温度对工作电极传感性能的影响曲线，由图可知，工作电极在20～35℃温度范围内可保持较大的稳态电流差值，当温度高于35℃时稳态电流差值降低较快，这可能是由于温度升高会改变酪氨酸酶构象，影响酪氨酸酶活性，进而使稳态电流差值降低[18]。

图4 工作电极在不同pH下还原峰电流测试结果

图5 工作电极在不同ZnO添加量下还原峰电流测试结果

图6 工作电极在不同温度下稳态电流差值测试结果

2.4 工作电极传感性能检测

在上述优化条件下采用计时电流法以Tyr/ZnO/CS/GCE 为工作电极检测邻苯二酚。在电解液中先滴加2.5μmol/L邻苯二酚溶液，再连续滴加5μmol/L邻苯二酚溶液得到计时电流曲线见图7(a)。由图7(a)可知，即使加入微量的邻苯二酚也能引起响应电流的快速增大，且达到稳定电流所需时间小于5s，表明该修饰电极对邻苯二酚有良好的催化能力，但超过该电极的检测范围后电流值将不再继续变化。不同邻苯二酚浓度与对应电流值的拟合结果见图7(b)，该方法检测邻苯二酚的线性检测范围为5～50 μmol/L，传感元件灵敏度为376.31μA/(mmol·L·cm2)，最低检测限为1.9041μmol/L。

表1为部分电化学生物传感器检测酚类物质时的效果，纯ZnO无酶传感器检测范围较窄且灵敏度不大，而还原氧化石墨烯（rGO）的加入会极大地提高传感元件的灵敏度[19-20]。对于酪氨酸酶生物传感器，以1-乙烯基-3-乙基咪唑溴化铵（ViEtIm+Br-）聚合物微粒为载体的传感元件适用于检测高浓度酚类物质[21]，而以2-羟基苯甲酰胺（2-HBZ）为载体的传感元件适用于检测极低浓度酚类物质[22]。相比于气相传输法制备的Tyr/ZnO-NR/GCE 电极，利用静电纺丝法制备的Tyr/ZnO/CS/GCE 电极检测限和灵敏度均有一定改善[23]，且静电纺丝法适用于大规模制备，因此该电极在检测酚类物质时有一定优势。

图7 传感性能分析图

2.5 ZnO对工作电极传感性能的影响

为研究ZnO对工作电极传感性能的影响，比较了Tyr/ZnO/CS/GCE 电极和Tyr/CS/GCE 电极在相同体系中的传感性能。Tyr/CS/GCE 电极IT 测试结果见图8，该电极在检测邻苯二酚时检测范围为5～40μmol/L，灵敏度为856.80μA/(mmol·L·cm2)。与Tyr/ZnO/CS/GCE 电极IT 测试结果对比，Tyr/ZnO/CS/GCE 电极的检测范围比Tyr/CS/GCE 电极更宽，但灵敏度稍低于Tyr/CS/GCE 电极，这可能是由于ZnO 导电性较差的原因[图8(c)][4]。同时，Tyr/ZnO/CS/GCE 电极稳态电流值在邻苯二酚浓度超过65μmol/L 后趋于平稳，且不会衰减，而Tyr/CS/GCE电极稳态电流值在邻苯二酚浓度超过50μmol/L后逐渐下降，本文作者认为是由于酪氨酸酶活性降低导致稳态电流值减弱，由此认为ZnO 微纳米纤维材料可使酪氨酸酶更稳定[24]。

图8 ZnO对工作电极传感性能的影响及导电性对比分析图

2.6 Tyr/ZnO/CS/GCE 电极抗干扰性和循环稳定性测试

选取尿素、多巴胺和葡萄糖这3种电化学活性相近的物质进行Tyr/ZnO/CS/GCE 电极抗干扰性测试，结果见图9(a)。每次加入5μmol/L邻苯二酚后，电流值均会发生明显变化，可断定该电极会对邻苯二酚产生响应。当分别加入5μmol/L葡萄糖、尿素和多巴胺时，电流值只产生了微小波动[图9(b)]，其中，加入葡萄糖对检测邻苯二酚过程的干扰影响最大，但其电流变化量也仅为加入邻苯二酚时的4.9%，由此可认为该工作电极使这3种物质对检测邻苯二酚的传感过程干扰很小，表明该电极具有良好的抗干扰性。通过对Tyr/ZnO/CS/GCE 电极进行循环稳定性测试发现，该电极在15 天后可保持初次测试性能的91%，30 天后仍可保持原性能的82%，表明该电极循环稳定性良好[25]。

图9 Tyr/ZnO/CS/GCE电极抗干扰性结果

3 结论

利用静电纺丝法制备了由近似球状的颗粒连接而成的ZnO微纳米纤维材料。利用该ZnO微纳米纤维材料构建了Tyr 生物传感器用于检测邻苯二酚，在优化检测条件下，Tyr/ZnO/CS/GCE 电极对邻苯二酚的检测范围为5～50μmol/L，检测限为1.9041 μmol/L，灵敏度为376.31μA/(mmol·L·cm2)，在加入尿素、多巴胺和葡萄糖这3种电化学活性相近物质的情况下仍能表现出很好的抗干扰性，且循环稳定性良好。因此，该生物传感器经过进一步改性后有望被视为潜在的工业废水中酚类物质含量检测方法。