三唑酮分子印迹纳米球的制备及应用

李子怡，李志君，顾丽莉，师君丽，陈昱安，韩毅，佟振浩，孔光辉

（1 昆明理工大学化学工程学院，云南昆明650500；2 云南省烟草农业科学研究院，云南玉溪653100）

三唑类杀菌剂是一类含有1,2,4-三唑环的化合物，由于其低毒、内吸性强、持效期长等优点，广泛应用于果蔬和稻谷等病虫害的防治[1]。杨益军[2]统计了2015 年全球销售额前15 位的杀菌剂，三唑类有5种，占1/3。但随着三唑类农药的大量应用，其在农产品和环境中的残留问题也逐渐引起人们的关注。目前，三唑类杀菌剂残留量的测定方法[3-12]主要有气相色谱法、液相色谱法、气质联用、液质联用、毛细管电泳法和生物免疫检测法等，这些检测方法均要求配备高效的样品前处理过程。

近年来，基于分子印迹技术的三唑类杀菌剂残留分析已有报道。佘永新等[13]研发了一种三唑类分子印迹聚合物微球固相萃取柱，微球粒径为2μm左右，该报道没有明确聚合物粒径与其吸附性能的关系；胡艳云等[1]建立了三唑酮分子印迹固相萃取-液相色谱-质谱法测定果蔬中多种三唑类农药的检测，但其特异性吸附效果不显著，最大印迹因子为1.45。针对三唑类分子印迹聚合物颗粒粒度较大（1～2μm 及以上）、粒径分布宽、团聚现象明显、印迹效果不显著等问题，本文制备了一种粒度高度均匀、特异吸附性能良好的分子印迹纳米球，该纳米球对模板分子及其结构类似物具有良好的选择性吸附能力和较高的印迹效应。由此分子印迹纳米球组装的固相萃取柱用于烟草样品的前处理，对烟草样品中三唑类杀菌剂的检测效果良好，为复杂基质中该类农残的检测提供了有效手段。

1 实验材料和方法

1.1 仪器与材料

扫描电子显微镜（SEM），Tecnai G2 TF30 STwin 型，荷兰FEI 公司；马尔文粒度分析仪，Zetasizer Nano ZS90 型，美国Malvern Inc；傅里叶红 外 光 谱 仪（FTIR）， Equinox55 型， 德 国BRUKER 公司；台式高速离心机，TG16-WS 型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；旋转蒸发仪，RE-2000A 型，上海亚荣生化仪器厂；气浴恒温振荡器，ZD-85 型，金坛市城东新瑞仪器厂；超高效液相色谱仪，Agilent 1290 Infinity UHPLC 型，美国Agilent Technologies；质谱仪，AB Sciex Qtrap (TM) 3200 MS/MS 型，美国AB Sciex，CA。

三唑酮（triadimefon，TDF），标准品纯度为99%，AccuStandard；三环唑（tricyclazole，TCZ），标准品纯度为99%，阿拉丁上海试剂有限公司；腈菌唑（myclobutanil，MT），标准品纯度为98.5%，阿拉丁上海试剂有限公司；亚胺唑（imibenconazole，IBZ）、烯唑醇（diniconazole，DNZ）、戊 唑 醇（tebuconazole，TEB）、己 唑 醇（hexaconazole，HXZ）、氯 磺 隆（chlorsulfuron，CS）和莠去津（atrazine,ATZ），标准品纯度为97%、99.2%、99.3%、98%、99%和99%，德国Dr. Ehrenstorfer 公司；丙环唑（propiconazole，PPZ），纯度为91.3%，CATO Research Chemicals Inc.；氟硅唑（flusilazole，FSZ），标准品纯度为98%，天津希恩思生化科技有限公司；偶氮二异丁腈[2,2´-azobis(2-methylpropionitrile)，AIBN]和乙二醇二甲基丙 烯 酸 酯 （ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA），分析纯，北京百灵威科技有限公司。

1.2 三唑类分子印迹预组装体系的计算机模拟

本文采用密度泛函理论（density functional theory，DFT）[14-16]，通过Gaussian09 模拟计算了5种功能单体分别与TDF 的复合物构型、结合能及其强度分布，推测出不同功能单体与TDF 的聚合比例；计算了最佳复合物在5种溶剂中的溶剂化能与偶极矩；进而估算了最佳复合物在最优溶剂中自组装过程的热力学性质和红外光谱图。

1.3 三唑酮分子印迹纳米球制备条件

100mL硼硅酸玻璃瓶中依次加入0.2mmol TDF、0.8mmol MAA 和50mL 乙腈，混合均匀，30℃下超声通N210min 后置于30℃恒温气浴振荡器中预聚12h，然后加入30mg AIBN和4mmol EGDMA，混合均匀，通N210min后置于30℃恒温水浴震荡器，随后将温度缓慢升至60℃，聚合24h。聚合结束后，将聚合物静置至室温，在10000r/min 下离心分离，倒掉上清液，将干燥后的聚合物放入索氏提取器，用甲醇∶乙酸=9∶1 重复洗脱聚合物中的模板分子，至超高效液相色谱（UHPLC）检测上清液中无TDF 为止。继而用甲醇洗涤聚合物呈中性后，将聚合物置于50℃下真空干燥至恒重，得到三唑酮分子印迹聚合物（TDF-MIPs）。作为对照，非分子印迹聚合物（NIPs）的制备除了不加入模板分子外，所有步骤与MIPs的制备一致[17-20]。

1.4 静态吸附实验

准确称取20mg 的MIPs 和NIPs 各12 份于10mL离心管中，分别加入不同浓度（0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、0.8mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L 和25mg/L）的TDF-乙腈溶液5mL。将离心管在25℃下恒温振荡8h，然后在8000r/min 下离心10min，取3mL 上清液用0.22μm滤膜过滤后用UHPLC 检测TDF 的浓度。该过程平行实验3次，检测结果取平均值[21-22]。

1.5 选择性吸附实验

准确称取20mg MIPs 和NIPs 各11份于10mL 离心管中，分别加入5mL 浓度为20mg/L 的不同种类农残标准品的乙腈溶液。将离心管在25℃下恒温振荡8h 后，在8000r/min 下离心10min，取3mL 上清液过0.22μm 滤膜后用UHPLC 检测各种农残的浓度。该过程平行实验3次，检测结果取平均值。

1.6 分子印迹固相萃取柱的装填

准确称取若干份100mg 的MIPs 及NIPs，分别装填于3mL 的固相萃取空柱中，填料上下两端放置0.45μm 滤 膜， 制 得MISPE 柱（molecularly imprinted solid phase extraction，MISPE）和NISPE柱（noimprinted solid phase extraction，NISPE）。

表1 9种三唑类杀菌剂的标准曲线、线性范围、相关系数、检测限及定量限

1.7 标准曲线与检出限和定量限

分别称取9 种三唑类杀菌剂10mg 溶于乙腈溶液，配制为100mg/L混标溶液，然后稀释为不同浓度（0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2 mg/L、0.5mg/L、1mg/L和2mg/L），采用UHPLC-MS/MS分析检测。色谱柱条件为：Waters BEH-C18（2.1mm×150mm，1.7μm）；流速，0.3 mL/min；检测波长，228nm；进样量，1μL；柱温，30℃；洗脱方式，梯度洗脱，流动相A、B分别为0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液。质谱仪条件为：电喷雾离子源；离子喷射电压，5500V；雾化温度，550℃；扫描方式，正离子扫描；检测方法，多反应检测模式。以杀菌剂的浓度为横坐标X，响应峰面积为纵坐标Y，在不加权的情况下对检测结果进行回归运算，得到9种农药的标准曲线，如表1所示。数据表明，9种杀菌剂在一定范围内线性关系良好（r≥0.9995），检测限为4.82～11.97ng/mL（S/N≥3），定量限为16.07～39.90ng/mL（S/N≥10）。

1.8 烟叶样品及烟叶上样液的制备

将烟叶破碎后过40 目筛，在50℃恒温真空干燥至恒重。称取若干份1g 干燥烟叶样品，分别置于10mL 离心管中，添加不同浓度的9 种农残混合标准溶液1mL，加标浓度分别为0.01μg/g、0.05μg/g、0.1μg/g、0.5μg/g，然后涡旋振荡5min 使其充分混匀，室温静置24h 后放入50℃真空干燥箱干燥2h，即得到加标烟叶样品。

向加标烟叶样品中加入10mL 乙腈，30℃下超声萃取30min后离心收集上清液，过0.22μm滤膜，将滤液转移到50mL 旋转蒸发瓶中，待旋蒸。滤渣与离心管底部的烟叶萃余物合并，再加入5mL 乙腈进行第二次萃取（萃取条件同第一次）。合并两次萃取滤液，旋转蒸发后，用1mL 乙腈复溶，得烟叶上样液。

2 实验结果与讨论

2.1 三唑类分子印迹预组装体系的计算机模拟

2.1.1 模板分子与功能单体的构型优化

模板分子TDF 与5 种单体（TFMAA、AA、AM、MAA 和4-VP）的几何构型及静电势分布如图1所示。TDF有3个失电子和1个弱受电子位置，AA、AM和MAA均各有1个失电子和1个受电子位置，TFMAA 有一个受电子位置，4-VP 有1 个失电子位置，根据电正性和电负性越强的地方形成非共价键的活性越高原理[15]，可初步判断模板分子与功能单体的最大结合比例。

图1 TDF与单体TFMAA、AA、AM、MAA和4-VP的静电势分布图

2.1.2 复合物的结构及配比优化

TDF 与5 种功能单体的相互作用能（ΔE）、键长与键角列于表2。从表2中可见，AM与TDF的相互作用能较低，而且小于自身缔合作用，为不可选功能单体。4-VP 与TDF 的键长已超出典型氢键键长1.627～2.169Å（1Å=0.1nm）[23-24]范围，无法与TDF 形成预聚合物。MAA 与TFMAA 在AA 结构上增加甲基或三氟甲基，可增加AA结构稳定性，增强羟基H 的受电子能力；TFMAA 的三氟甲基具有电负性，消减了羟基H 给电子能力，MAA 中的羟基H给电子能力更强。TDF的3个失电子元素分别与三分子MAA 的受电子元素形成3 个氢键，而TDF上的1个弱受电子元素与MAA的1个失电子元素不能形成氢键，且TDF-MAA 复合物的|ΔE|高于TDF-TFMAA 复合物的|ΔE|。表3 是TDF 与MAA 和TFMAA 在各结合点位的作用能。由表3 和图1 可见，TDF 在O3、N5 和N6三个个结合位点可以接受质子，原子电荷数分别为-0.311、-0.312和-0.311，均可与TFMAA和MAA形成氢键结构。TDF在N5与MAA 的相互作用结合能较大，在N6 和O3 的结合能相近，且3个结合位点的结合能相近；而TDF与TFMAA 在N6 的结合能与在N5和O3的结合能差异较大。因此，TDF-MAA 比TDF-TFMAA 的复合结构更为稳定[25-26]。后续MIPs 的制备中采用MAA 为功能单体，并考虑TDF 与MAA 之间存在的氢键之外的弱作用力影响，选择TDF 与MAA 的聚合比例为1∶4。图2为TDF与4种功能单体的预聚合构型优化及配比情况[27]。

表2 TDF与5种单体相互作用能ΔE、键长与键角

表3 TDF与MAA和TFMAA各结合点位的作用能

实验中，通过检测不同配比下[(1∶1)～(1∶4)]预聚合物的紫外光谱。在1∶4 时，吸光度最小，说明TDF 与MAA 自组装过程最强，进而印证了TDF与MAA配比为1∶4时自组装效果最佳[28-29]。

2.1.3 溶剂的选择

图2 TDF分别与4种功能单体形成复合物的几何结构

溶剂对TDF-MAA 复合物的溶剂化会促进氢键断裂和降低反应活性。将实验与模拟结合可快速选择最佳溶剂，制备方法为沉淀聚合法。分别选择了微孔型甲苯、氯仿、大孔型二氯甲烷、乙腈和水5种溶剂对印迹体系的溶剂化效应进行模拟研究[30]。如表4所示，ΔE溶剂越大说明溶剂对TDF-MAA复合物结构影响越大，越不利于形成氢键，不利于自组装过程的进行，按照溶剂化能从小到大的顺序排序：甲苯＜氯仿＜二氯甲烷＜乙腈＜水，取前4种有机溶剂进行实验比较。

表4 TDF-MAA在5种溶剂中的溶剂化能和偶极矩

在相同条件下，制备4 种溶剂的MIPs，结果表明：以甲苯和二氯甲苯为溶剂所制备的MIPs 产量少，团聚明显，球形度差，粒径误差大。氯仿-MIPs 微球粒径为1000nm 左右，乙腈-MIPs 微球粒径在200～300nm 之间，乙腈-MIPs 微球的比表面积远高于氯仿-MIPs 微球，进一步用20mg/L TDF溶剂作为吸附质进行吸附实验，结果表明：乙腈-MIPs 最 大 吸 附 量 是955.3μg/g，而 氯 仿-MIPs 是250μg/g，相差3.8倍。大孔溶剂形成的大孔结构更利于物质扩散，适当提高大孔数量将有利于MIPs对模板分子及其类似物的识别能力。故而，乙腈是沉淀聚合法制备TDF-MIPs的适宜溶剂。

2.1.4 复合物的红外光谱分析

图3(a)为复合物在真空介质和乙腈溶剂中模拟的红外光谱图，图3(b)为乙腈-MIPs 红外光谱图。比较乙腈-复合物的模拟光谱线和乙腈-MIPs 实体的光谱线，两者的主要吸收峰位置相似，说明计算机模拟的红外光谱具有相对准确性。与真空介质对比，两者的吸收光谱均发生红移现象，表明预聚合反应中模板与单体氢键结合的激发态能量传递给乙腈分子，基团在乙腈中振动所需的能量降低，直接影响结构的稳定性。由此可见有必要考察适宜的溶剂用量，有益于形成稳定的聚合物结构。

图3 模拟TDF-MAA复合结构和乙腈-TDF-MIPs红外光谱图

在相同条件下，改变乙腈用量（30mL、40mL、50mL、60mL、70mL 和80mL）制备了6 种不同的TDF-MIPs 和NIPs。通 过UHPLC 检 测6 种TDFMIPs 和NIPs 的饱和吸附量（20mg/L TDF-乙腈溶剂），计算其印迹因子，如表5 所示，结果表明：随着溶剂量的增加，TDF-MIPs 微球饱和吸附量先增加后减少，与印迹因子的变化规律一致，其中，溶剂量50mL的MIPs微球分布分布最窄，平均粒径较小，其吸附性和结构性更稳定。

表5 不同溶剂用量下MIPs的饱和吸附量、印迹因子与粒度特征

2.1.5 复合物自组装过程的热力学分析

在特定温度下，根据正则系综理想气体估算分子热力学数据（H、G和S）[15]。模拟中选择不同温度（0～30℃）和不同介质（真空与乙腈）下，对复合物自组装过程：TDF+3MAATDF-MAA 进行热力学分析，表6 是复合物自组装过程的焓变（ΔH）、熵变（ΔS）和吉布斯自由能变化（ΔG）。

由表6可见，复合物形成过程中，ΔH和ΔG均大于零，ΔS 为负值，随着温度的升高，三者均有小幅度增加，表明TDF-MAA预聚合反应是非自发吸热反应，但温度对反应影响不大，实验中选择30℃进行预聚合反应。

2.2 三唑酮分子印迹聚合物纳米球性能表征

表征最优条件（1.3 节）下的TDF-MIPs 的形貌、粒径等基本性能。

图4(a)中TDF-MIPs 粒径在200nm 左右，无粘连和团聚现象，非平滑均匀准球表明存在大量多层次褶皱，预示该聚合物有较大的比表面积，有利于目标化合物的吸附和脱附。从TDF-MIPs 粒度分布图4(b)显而易见，聚合物粒径均匀，主要集中在190～220nm，与场发射扫描电镜结果一致。

图4 TDF-MIPs的形貌和粒径图

图5 TDF、TDF-MIPs与NIPs的红外光谱图

TDF、TDF-MIPs 洗脱前、TDF-MIPs 洗脱后及NIPs 的红外光谱见图5。TDF-MIPs 洗脱前光谱图中出现4 处明显特征峰，波数673.7cm-1处是C Cl伸缩振动峰；1586.4cm-1处是芳环中C C伸缩振动峰，即TDF中苯环的骨架振动；1665cm-1处是羰基C O伸缩振动峰，因在NIPs和TDF-MIPs洗脱后未出峰，可以排除是甲基丙烯酸中的羰基，则此处为TDF中的羰基；3130cm-1处为苯环上不饱和的C H伸缩振动峰，TDF 在以上4 处均有对应峰值出现。由此证明，聚合物中存在TDF 分子；对比图TDFMIPs洗脱后，不存在这4处特征峰，说明聚合物中的TDF分子被完全洗脱。此外，分析以上4个红外光谱图所共有的较强特征峰发现，1158cm-1处可能为交联剂EGDMA 中O C O 的伸缩振动峰；1257cm-1处可能为功能单体MAA 羧基中C O 的伸缩振动峰；1730cm-1处为EGDMA 和MAA 中C O的伸缩振动峰。综上，可以证明EGDMA 和MAA的存在，并且模板分子与功能单体、交联剂发生了共聚反应。

表6 在不同条件下复合物形成过程的热力学相关数据

2.3 静态吸附实验

图6(a)是TDF-MIPs及NIPs在不同TDF-乙腈溶液中的吸附量。从图6(a)中可以看出，MIPs的结合量随着TDF 浓度的增加而增加，因具有高亲和吸附位点（特异性吸附）和低亲和吸附位点（表面吸附特性），相比只有表面吸附特性的NIPs有更高的吸附容量。图6(b)为Scatchard分析后线性拟合结果图，分别拟合得到MIPs高亲和直线与低亲和直线，两者斜率不同，说明TDF-MIPs 存在两类吸附位点。根据Scatchard分析，计算得到高亲和位点的解离常数为15.237μg/mL和最大表观结合量是1502.582 μg/g。低亲和位点的解离常数为2.039μg/mL和最大表观结合量是522.99μg/g。

2.4 选择性吸附实验

图6 静态吸附实验数据图

图7 TDF-MIPs和NIPs的选择性吸附及印迹因子

为了考察所制备的TDF-MIPs选择性识别能力，选用9 种常见三唑类杀菌剂、1 种磺酰脲类和1 种三嗪类除草剂为目标物，检测TDF-MIPs对以上11种农药的吸附量。结果如图7所示。

图7 表明，除氟硅唑外，TDF-MIPs 对上述8种三唑类杀菌剂具有良好的吸附性，最大印迹因子可达到2.42，相较于NIPs，MIPs 的吸附量和特异吸附性均较高。TDF-MIPs 的孔穴在空间结构和结合点位上与TDF 分子切合，能够有效地嵌入TDF实现特异性吸附和分离，而分子结构的类似性使TDF-MIPs 对三唑类化合物具有普遍的特异吸附性。相对而言，NIPs 仅能对各种农残分子进行表面吸附。对于氟硅唑，其分子量大、空间结构与TDF 分子的结构差异较大，TDF-MIPs 的主要作用为表面吸附，其MIPs 与NIPs 的吸附量基本一致，更小粒径的NIPs 反而有更高的表面吸附量。TDFMIPs 对非类似结构的氯磺隆和莠去津基本无特异性吸附。

2.5 三唑酮分子印迹聚合物纳米球的应用

取空白烟叶样品，按照1.7 节和1.8 节进行制样、样品前处理和检测，计算回收率和标准偏差，结果列于表7。由表7 可见，除氟硅唑外，其他8种三唑类杀菌剂在加标浓度为0.01～0.5μg/g 范围内的平均回收率为70.14%～105.43%，多次测量的标准偏差为0.26%～2.27%。同一浓度水平下，三唑酮和腈菌唑的平均回收率达95%以上，戊唑醇、己唑醇和烯唑醇高于85%，丙环唑、三环唑和亚胺唑大于70%，氟硅唑仅为50%～60%，TDF-MIPs的吸附性能与2.4节的选择性吸附结论一致。

3 结论

本文以沉淀聚合法制备了粒度高度均匀、特异性吸附性能良好的TDF-MIPs 纳米微球，并以TDF-MIPs 为吸附剂，对烟叶样品进行固相萃取前处理，建立了TDF-MISPE-UPLC-MS/MS 方法对烟叶中8种三唑类杀菌剂的残留进行同时检测。研究主要分为计算机模拟与实验两部分。

表7 加标回收率和精密度（n=6）

（1）运用Gaussian09软件针对TDF筛选最优功能单体MAA，分析了TDF 与MAA 潜在的结合位点并得到最大配比数；模拟了常用的5种不同极性与致孔特性的溶剂对TDF-MAA溶剂化效应，并通过实验确定乙腈为沉淀聚合溶剂；估算了TDF-MAA在真空和乙腈中的预聚合过程与红外光谱图，从热力学角度分析得到TDF+MAATDF-MAA 为吸热非自发过程，确定预聚合温度为30℃。

（2）通过改变溶剂和用量得到了聚合物最佳配比TDF∶MAA∶EGDMA=1∶4∶20，乙腈50mL，AIBN 0.03g；所得TDF-MIPs 纳米颗粒均匀，平均粒径为200nm，最佳饱和吸附量可达955.3μg/g，对模板分子的分离印迹因子达到2.42，对其他常用三唑类杀菌剂也具有良好的特异性吸附能力。

（3）以TDF-MIPs 为吸附剂，对烟叶样品经固相萃取柱进行前处理，并用UPLC-MS/MS 分析前处理液，烟叶中8种三唑类杀菌剂的固相萃取回收率为70.14%～105.43%，检出限为4.82～11.97ng/mL，相对标准偏差为0.26%～2.27%（n=6），由此建立了TDF分子印迹固相萃取-超高效液相质谱联用方法，并对烟叶中8种三唑类杀菌剂（三唑酮、腈菌唑、戊唑醇、己唑醇、烯唑醇、丙环唑、三环唑及亚胺唑）的残留进行检测，达到了复杂基质烟叶中多种痕量三唑类杀菌剂同时检测的要求。